Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células
Summary
Presentamos nuestra optimizado de alto rendimiento protocolo nucleofection como una forma eficiente de la transfección de primaria monocitos humanos derivados de células dendríticas, ya sea con el ADN de plásmido o siRNA sin causar la maduración celular. Nos proporcionan evidencia adicional para silenciar siRNA éxito de gen diana RIG-I tanto en el mRNA y los niveles de proteína.
Abstract
Las células dendríticas (DC) se puede considerar centinelas del sistema inmunitario que juegan un papel crítico en la iniciación y respuesta a la infección 1. La detección de antígenos patogénicos por los países en desarrollo ingenuo es a través de los receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que son capaces de reconocer estructuras específicas de conservación conocido como patógeno de patrones moleculares asociados (PAMP). La detección de PAMP por los países en desarrollo desencadena una cascada de señalización intracelular que resulta en su activación y transformación de los países en desarrollo maduro. Este proceso se caracteriza típicamente por la producción de interferón tipo 1, junto con otras citocinas proinflamatorias, la regulación positiva de los marcadores de superficie celular, como MHCII y CD86 y la migración de las DC maduras a los ganglios linfáticos de drenaje, donde la interacción con las células T se inicia la respuesta inmune adaptativa 2, 3. Por lo tanto, los países en desarrollo enlace del sistema inmune innato y adaptativo.
La capacidad de diseccionar las redes moleculares que subyacen a la respuesta de DC a varios patógenos es fundamental para una mejor comprensión de la regulación de estas vías de señalización y de sus genes inducidos. También debe ayudar a facilitar el desarrollo de la DC, las vacunas contra las enfermedades infecciosas y tumores. Sin embargo, esta línea de investigación se ha visto gravemente obstaculizada por la dificultad de la transfección de primaria DC 4.
Métodos de transducción de virus, como el sistema de lentiviral, se utilizan normalmente, pero tienen muchas limitaciones, como la complejidad y la bio-peligrosos de riesgo (con los costos asociados) 5,6,7,8. Además, la entrega de los productos de los genes virales aumenta la inmunogenicidad de los países en desarrollo transducidas 9,10,11,12. La electroporación se ha utilizado con resultados mixtos 13,14,15, pero nosotros somos los primeros en reportar el uso de un protocolo de transfección de alto rendimiento y demuestran de forma concluyente su utilidad.
En este informe se resume un protocolo optimizado comerciales de alto rendimiento para la transfección de los países en desarrollo humano primario, con una toxicidad celular limitado y la falta de maduración de las DC 16. Eficiencia de transfección (del plásmido GFP) y la viabilidad celular fueron más del 50% y 70% respectivamente. FACS análisis estableció la ausencia de aumento en la expresión de la maduración de los marcadores CD86 y MHCII en las células transfectadas, mientras que QRT-PCR demostró que no había regulación al alza de IFNβ. El uso de este protocolo de electroporación, aportar pruebas para la transfección exitosa de países en desarrollo con siRNA y efectiva de derribar gen diana RIG-I, un receptor clave reconocimiento viral 16,17, tanto en el mRNA y los niveles de proteína.
Protocol
Discussion
Transfección eficiente de ingenuo células dendríticas primaria es importante para el análisis de alto rendimiento e ingeniería inversa de celulares vías inflamatorias en esta celda mediador clave de la transición inmune innato-adaptación. Sin embargo, la mayoría de los investigadores encuentran que estas células son difíciles de transfectar de forma eficiente y sin la maduración procedimiento de transfección de células inducen al uso de técnicas estándar de transfección. Nosotros investigamos si estas l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto fue apoyado por el NIH NIAID Contrato HHSN2662000500021C N º. Damos las gracias a Ming Chen por su asistencia técnica.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
Referências
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