Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden
Summary
Vi presenterar våra optimerade hög genomströmning nucleofection protokoll som ett effektivt sätt att transfecting primära humana monocyt-härledda dendritiska celler med antingen plasmid DNA eller siRNA utan att orsaka cellmognaden. Vi ger ytterligare bevis för framgångsrik siRNA tysta riktade genen Rig-i på både mRNA-och proteinnivåer.
Abstract
Dendritiska celler (DC) kan anses vara vaktposter av immunsystemet, som spelar en avgörande roll i initiering och svar på infektion 1. Upptäckt av patogena antigen genom naiv Utvecklingsländerna är via receptorer mönsterigenkänning (PRRS) som kan känna igen specifika bevarade strukturer som kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPS). Upptäckt av PAMPs av utvecklingsländernas utlöser en intracellulär signalering kaskad resulterar i aktivering och omvandling till mogna utvecklingsländer. Denna process är normalt kännetecknas av produktion av typ 1-interferon tillsammans med andra proinflammatoriska cytokiner, uppreglering av markörer på cellytan som MHCII och CD86 och migration av den mogna DC till dränering lymfkörtlar, där interaktionen med T-celler initierar det adaptiva immunsvaret 2, 3. Således fick utvecklingsländer länk det medfödda och adaptiva immunsystem.
Förmågan att dissekera den molekylära nätverk som ligger bakom DC svar på olika patogener är avgörande för en bättre förståelse av regleringen av dessa signalvägar och deras inducerade gener. Det bör också bidra till att underlätta utvecklingen av DC-baserade vacciner mot infektionssjukdomar och tumörer. Emellertid har denna forskningsinriktning allvarligt hindras av svårigheten att transfecting primära utvecklingsländernas 4.
Virus transduktion metoder, såsom Lentiviral systemet används normalt, men bär många begränsningar, såsom komplexitet och biologiskt farliga risker (med tillhörande kostnader) 5,6,7,8. Dessutom ökar leveransen av gener produkter immunogeniciteten av dessa transduced utvecklingsländernas 9,10,11,12. Elektroporation har använts med blandat resultat 13,14,15, men vi är de första att rapportera användningen av en hög genomströmning transfektion protokollet och slutgiltigt visa sin nytta.
I denna rapport sammanfattar vi en optimerad kommersiella protokoll för hög genomströmning transfektion av människans primära utvecklingsländerna, med begränsad celltoxicitet och avsaknad av DC mognad 16. Transfektion effektivitet (av GFP plasmid) och cellviabiliteten var mer än 50% respektive 70%. FACS analys etablerade avsaknad av ökningen uttryck för mognad markörerna CD86 och MHCII i transfekterade celler, medan QRT-PCR visade inga uppreglering av IFNβ. Med hjälp av denna elektroporation protokoll ger vi belägg för framgångsrik transfektion av DCS med siRNA och effektivt slå ner riktade gen RIG-I, en nyckel virus erkännande receptorn 16,17, både på mRNA-och proteinnivåer.
Protocol
Discussion
Effektiv transfektion av naiva primära dendritiska celler är viktig för hög genomströmning analys och reverse engineering av cellulära inflammatoriska vägar i denna nyckel cellen förmedla det medfödda-adaptiva immunförsvaret övergången. De flesta utredarna tycker att dessa celler är svåra att transfektera både effektivt och utan det transfektion förfarande förmå cellmognaden när man använder vanliga transfektion tekniker. Vi undersökte om dessa begränsningar kan övervinnas genom hög kapacitet pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet fick stöd av NIH NIAID Kontrakt nr HHSN2662000500021C. Vi tackar Ming Chen för hans tekniskt bistånd.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
Referências
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
