Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

Resumo

A simplificada ainda método preciso para coletar e mancha hemócitos mosquito é descrito. Nosso método combina a simplicidade de perfusão com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes. Este método facilita os estudos que exigem conhecimento dos tipos de hemócitos e sua abundância.

Resumo

Os mosquitos são vetores de uma série de patógenos causadores de doenças como o vírus da febre amarela, malária e parasitas worms filarial. Laboratórios estão investigando anti-patógeno componentes do sistema imune inato na espécie dos vectores de doenças, na esperança de gerar mosquitos transgênicos que são refratários à patógenos, ^{1, 2.} O sistema imune inato de mosquitos consiste de vários mecanismos de defesa ^3. Patógenos que conseguem escapar da barreira imposta pelo mosquito epitélio do intestino médio-lined ⁴ entrar na hemolinfa e encontrar hemócitos circulantes, importantes componentes celulares que sintetizam e patógenos engulf ^{5, 6.} Os pesquisadores não encontraram evidências de tecido hematopoiético em mosquitos e evidência atual sugere que o número de hemócitos é fixada em emergência de adultos e os números podem realmente diminuir com a idade mosquito ^7. A habilidade para recolher e identificar hemócitos de insetos de importância médica é um passo essencial para os estudos da imunidade celular. No entanto, o pequeno tamanho dos mosquitos e do volume limitado de hemolinfa representam um desafio para coleta de células do sistema imunológico.

Dois métodos estabelecidos para a recolha de hemócitos mosquito incluem a expulsão de hemolinfa a partir de uma tromba de corte ^8, e deslocamento de volume (perfusão), em que solução salina é injetada na região membranosa necklike entre a cabeça eo tórax (ie, colo do útero) ea hemolinfa perfundidos é coletada a partir de uma abertura rasgada em uma região distal do abdômen ^{9, 10.} Estas técnicas, no entanto, são limitados pela baixa recuperação de hemócitos e possível contaminação por células de gordura corporal, respectivamente ^11. Mais recentemente, um método conhecido como recuperação de injecção / alta recuperação melhorada de imunócitos pelo uso de buffers anticoagulante, reduzindo os níveis de escalas de contaminantes e tecidos internos ^11. Enquanto que o método permite um método melhorado de coleta e manutenção hemócitos para cultura primária, envolve uma série de injeção e as etapas de coleta que não são necessárias se o objetivo é coletar a jusante, corrigir e mancha hemócitos para diagnósticos. Aqui, demonstramos o nosso método de coleta de hemolinfa mosquito que combina a simplicidade de perfusão, usando buffers anticoagulante em lugar de solução salina, com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes.

Protocolo

1. Preparação antes da coleta de hemócitos

1. Prepare uma solução diluente hemolinfa que consiste em 60% Medium Schneider, 10% de soro fetal bovino (FBS), e tampão citrato 30% (anticoagulante; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM de ácido cítrico, pH 4,5) ^11. Faça alíquotas 1,0 mL que podem ser armazenadas a -20 ° C. Use cada alíquota apenas uma vez (veja Materiais).
2. Prepare lâminas de vidro de microscópio (75 x 25 x 1 mm), marcando um círculo 1 cm de diâmetro em uma extremidade usando uma ferramenta de gravação de vidro. Alternativamente, lâminas de microscópio com dois pré-gravado círculos podem ser adquiridos (por exemplo, Fishe....

Discussão

O método de coleta de hemócitos aqui descrita é modificada a partir de métodos publicados anteriormente e permite isolar os preparativos limpa de hemócitos de Aedes mosquitos com menos etapas. Enquanto o nosso interesse particular reside na caracterização de populações de hemócitos em mosquitos Aedes, acreditamos que esta técnica pode ser aplicada a grupos mosquito outros após testes iniciais são realizados para determinar volumes de injeção adequada. Nosso protocolo utiliza buffers anticoagulante em l.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Médio Schneider	Sigma-Aldrich	S0146
Soro fetal bovino	Sigma-Aldrich	F0643
Hema3 kit mancha	Pescador	123-869
Agulhas de vidro (Borosilicato com filamento)	Instrumento Sutter	BF100-78-10	1,0 milímetros e 0,78 milímetros OD ID
Extrator de agulhas	Sutter Instruments	Modelo P-87
Microinjetor	Tritech Research	Minj-PD
Porta agulha	Tritech Research	Minj-4