Um método simples blot slot foi desenvolvido para a quantificação da gripe hemaglutinina e neuraminidase viral utilizando anticorpos universal, direccionado para suas seqüências mais conservadas identificados através de análises de bioinformática. Esta abordagem inovadora pode fornecer uma alternativa útil para determinação quantitativa de todos os hemaglutinina e neuraminidase viral.
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Artigo de método
Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot
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Resumo
Resumo
Hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são duas proteínas de superfície do vírus da gripe que são conhecidos por desempenhar um papel importante no ciclo de vida viral ea indução de proteção 1,2 respostas imunes. Como o principal alvo para anticorpos neutralizantes, HA é atualmente utilizada como marcador de potência da vacina de gripe e é medido por imunodifusão radial simples (SRID) 3. No entanto, a dependência do SRID sobre a disponibilidade dos anti-soros correspondentes subtipo específico causa um mínimo de 2-3 meses de atraso para o lançamento de cada nova vacina. Além disso, apesar da evidência de que NA também induz imunidade protetora 4, a quantidade de NA em vacinas contra a gripe ainda não é padronizada, devido à falta de reagentes apropriados ou método analítico 5. Assim, simples métodos alternativos capazes de quantificar antígenos HA e NA são desejáveis para a liberação rápida e melhor controle de qualidade de vacinas contra a gripe.
Regiões universalmente conservada em todas as influenza A HA disponível e seqüências de NA foram identificadas por análises de bioinformática 6-7. Uma seqüência (designado como Uni-1) foi identificado no epítopo só universalmente conservadas de HA, o peptídeo de fusão 6, enquanto duas seqüências conservadas foram identificados em neuraminidases, um perto do local enzimática ativa (designado como HCA-2) ea fechar outras para o N-terminal (designado como HCA-3) 7. Peptídeos com essas seqüências de aminoácidos foram sintetizados e usados para imunizar coelhos para a produção de anticorpos. O anticorpo contra o epitopo Uni-1 da HA foi capaz de se ligar a 13 subtipos de influenza A HA (H1-H13), enquanto os anticorpos contra o HCA-2 e HCA-3 regiões de NA foram capazes de se ligar todos os 9 subtipos de NA. Todos os anticorpos mostraram especificidade notável contra as seqüências virais como evidenciado pela observação de que qualquer reactividade cruzada com proteínas alantóide foi detectado. Estes anticorpos universal foram então usados para desenvolver ensaios blot slot para quantificar HA e NA em influenza A vacinas sem a necessidade de anti-soros específicos 7,8. Amostras da vacina foram aplicadas em uma membrana de PVDF usando um aparelho blot ranhura junto com padrões de referência diluído em concentrações variadas. Para a detecção de HA, amostras e padrão foram diluídos em primeiro Tris-buffered saline (TBS) contendo uréia 4M, enquanto para a medição de NA foram diluídos em TBS contendo 0,01% Zwittergent como estas condições melhoraram significativamente a sensibilidade de detecção. Após a detecção do HA e NA antígenos por immunoblotting com seus respectivos anticorpos universal, intensidades de sinal foram quantificados por densitometria. Quantidades de HA e NA nas vacinas foram calculados utilizando uma curva padrão estabelecida com a intensidade do sinal das várias concentrações de as referências utilizadas.
Dado que estes anticorpos se ligam a epítopos universal na HA ou NA, os investigadores interessados podem usá-los como ferramentas de pesquisa em imunoensaios que não seja o blot slot somente.
Protocolo
1. Preparação de reagentes e equipamentos
- Antes de iniciar o procedimento blot slot, prepare 20_mls de solução de uréia 4M em Tris-buffered saline (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) para a hemaglutinina, ou HA, blot slot, ou 20_mls de 0,01% Zwittergent solução TBS para a neuraminidase, ou NA, blot slot. Enquanto uréia 4M deve ser preparado de cada vez, uma solução estoque 10% Zwittergent em dH 2 O é estável durante pelo menos 6 meses em temperatura ambiente e pode, portanto, ser diluída para 0,01% em TBS antes de cada ensaio.
- Prepare 2.000 ml de tampão de lavagem por adição de Tween-20 a uma solução de TBS para uma concentração fi....
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Discussão
Determinação quantitativa da gripe viral HA e NA são fundamentais para a pesquisa e desenvolvimento de vacinas uma vez que essas duas proteínas de superfície são mais importantes componentes virais induzir respostas imunes 6-11. Relatado anteriormente métodos imunológicos para a detecção dessas proteínas exigem anticorpos cepa específica. O método blot simples, reprodutível e rápida slot para quantificar os antígenos HA e NA aqui descritos são adequados para todas as influenza A HA viral e proteínas NA desde .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Sra. Monika Tocchi para revisão editorial do manuscrito. AMH é apoiado por uma bolsa da King Abdulaziz Universidade, através da Arábia Saudita Bureau Cultural, no Canadá.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente ou equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Bio-Dot Aparelho Microfiltração SF | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF papel de filtro | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transferência de membrana (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Bomba de vácuo | Millipore | WP6111560 | |
| Quimioluminescência Film Luz BioMax | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Sistema de Documentação Gel | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal anticorpos de coelho contra antígenos HA e NA | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Anticorpos estão disponíveis através do MTA ou pode ser gerado por investigadores interessados de acordo com os procedimentos anteriormente descritos 6,7. | |
| Influenza antigénio de referência vacina | CBER / FDA ou NIBSC | ||
| Vacina contra a gripe amostras | Comumente disponíveis na maioria dos países | ||
| Uréia | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Detergente 14/03 Zwittergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Bloqueador de leite não-gordura seco | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Goat ImmunoPure Anti-IgG de coelho, (H + L), peroxidase conjugado | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal Oeste Dura Extended Substrato Duração | Thermo Scientific | 34075 |
Referências
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
