Dendritiska celler upptag antigener och vandrar mot immun organ för att presentera behandlas antigen till T celler. Qdot nanocrystal märkningen ger en långvarig och stabil fluorescerande signal. Detta möjliggör spårning av dendritiska celler till olika organ med fluorescerande mikroskopi.
Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler (APC) som finns i perifera vävnader och i immunologiska organ såsom tymus, benmärg, mjälte, lymfkörtlar och Peyers plack 1-3. DCs som finns i perifera vävnader prov organismen för förekomsten av antigener, som de tar upp, bearbeta och presentera i sin yta i samband med större histocompatibility molekyler (MHC). Sedan antigen-loaded DC migrera till immunologiska organ där de presenterar de bearbetade antigenet för T-lymfocyter som utlöser specifika immunsvar. Ett sätt att utvärdera flyttande förmåga DCS är att märka dem med fluorescerande färger 4.
Härmed har vi demonstrera användningen av Qdot fluorescerande nanokristaller att märka murina härledd från benmärg DC. Fördelen med denna märkning är att Qdot nanokristaller har stabila och långvariga fluorescens som gör dem idealiska för att upptäcka märkta celler i återhämtat vävnader. För att uppnå detta kommer först cellerna skall återkrävas från murina ben squash och odlade i 8 dagar i närvaro av granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor för att framkalla DC differentiering. Dessa celler ska sedan märkta med fluorescerande Qdots genom att korta in vitro inkubation. Färgade celler kan visualiseras med en fluorescerande mikroskopi. Celler kan injiceras i försöksdjuren vid denna punkt eller kan till mogna celler på in vitro inkubation med inflammatoriska stimuli. I våra händer gjorde DC mognad avgör inte förlust av fluorescerande signal heller Qdot färgning påverkar biologiska egenskaper av DCS. Efter injektionen, kan dessa celler identifieras i immun organ med fluorescerande mikroskop följande typiska dissektion och förfaranden fixering.
Murina myeloisk) Utvecklingsländerna har i stor utsträckning använts för att fastställa effekt och förbättring av DC-baserade vacciner, undersöka DC: T-cell interaktioner eller DC utveckling, och bestämma deras roll i olika sjukdomar 9-11. Härmed visar vi hur du skapar utvecklingsländerna från prekursorer återhämtat sig från ben squash av skenben och lårben. Vi återhämta benen utan att skära av tips, tillåter oss att sterilisera dem genom nedsänkning i etanol 70%, vilket minskar sannolikheten för förorening. För att skilja DCs från benmärgsceller använder vi bara GM-CSF som tidigare beskrivits 5. Även om vissa protokoll också använda IL-4, har det rapporterats att detta cytokin är inte nödvändigt när man arbetar med höga halter av GM-CSF 12. I själva verket har vi visat tidigare att dessa DCs kan inducera immunsvar 13. Dessutom har vård vidtas för att återkräva bara löst vidhäftande celler från 8-dagars kulturer genom att tvätta de petriskålar med medium sedan fäst celler visar en mer monocyte-liknande fenotyp. Här visar vi märkning av utvecklingsländerna med fluorescerande Qdot partiklar. Denna märkning har vissa fördelar gentemot andra metoder. Först är de Qdots partiklar lätt införlivas i cellerna. För det andra är fluorescerande signal mycket hög och ändras inte av DC-mognad. För det tredje är fluorescensen inte förlorade när cellerna eller vävnaderna fixeras med lösningsmedel som aceton, i motsats till vad som händer om GFP används för att märka utvecklingsländerna 14, vilket ger mer flexibilitet för tillfället att välja färgning protokoll. Slutligen ger den höga fluorescerande signal som ges av dessa partiklar visualisering av celler trots vävnaden auto-fluorescens. Som tidigare beskrivits 6, gjorde Qdot färgning påverkar inte mognaden kapaciteten av dessa celler. Härmed visar vi att Qdot-färgade DCs beter sig på ett liknande sätt som icke-färgade utvecklingsländerna, upregulating co-stimulerande molekyler och producera IL-6 och kväveoxid som svar på inflammatoriska stimuli. Även Utvecklingsländerna celler specialiserade på att utlösa immunsvar, de har visat att delta i sjukdomstillstånd som cancer och åderförkalkning 4, 15, 16. De har också hävdat att delta i angiogena process 17, 18, även föreslagits som strukturellt deltar i utvecklingen av nya fartyg 19, 20. Således metoder som möjliggör DC spåra in vivo, och bestämma deras geografiska lokalisering i olika vävnader 4, 21, 22 är mycket värdefulla.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds delvis av NIH i Grant R15 CA137499-01 (FB) och en start fond vid Ohio University (FB).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
C57BL/6 mice | Jackson laboratories | Females, 6-8 weeks old | |
RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
ACK Lysing Buffer | Lonza Walkersville, Inc | 10-548E | |
Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
Lipopolysaccharide | Invivogen | tlrl-eblps | |
Recombinant murine TNF alpha | Peprotech | 315-01A | |
CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
Griess reagent system | Promega | G2930 | |
IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |