Begränsa utspädningen celltransplantation analyser används för att bestämma frekvensen av tumör-förökningsmaterial celler. Detta protokoll beskriver en metod för att generera syngena zebrafisk som utvecklar fluorescerande-märkta leukemi och detaljer hur du kan isolera och transplantera dessa leukemiceller att begränsa utspädningen i bukhålan av vuxna zebrafisk.
Egen förnya cancerceller är den enda celltyper i en tumör som har en obegränsad förmåga att främja tumörtillväxt, och är därför känd som tumör-föröknings celler, eller tumör-inledande celler. Det är tänkt att inrikta sig på dessa själv förnya celler för destruktion blockerar tumörtillväxt och stoppa återfall, avsevärt förbättra patientens prognos 1. Det vanligaste sättet att bestämma frekvensen av själv-förnyar celler i en tumör är en begränsande utspädning celltransplantation test, där tumörceller transplanteras in i mottagaren djur vid ökande doser, andelen djur som utvecklar tumörer används för beräkning av antalet av själv-förnyar celler i den ursprungliga tumören urval 2, 3. Helst skulle ett stort antal djur skall användas i varje begränsa utspädningen experiment för att exakt fastställa frekvensen av tumör-förökningsmaterial celler. Men storskaliga försök med möss är kostsamma och mest begränsande utspädning analyser använder bara 10-15 möss per försök.
Zebrafisk ha vunnit ryktbarhet som en cancer modell, till stor del på grund av sin lätthet av genmanipulation och ekonomin genom vilka storskaliga experiment kan utföras. Dessutom har de cancertyper modelleras i zebrafisk funnit att noga härma deras motsvarighet mänskliga sjukdomar 4. Även om det är möjligt att transplantera tumörceller från en fisk till en annan genom subletala bestrålning av mottagare djur, regeneration av immunförsvaret efter 21 dagar ofta orsakar tumörregression 5. Den nyligen inrättade syngena zebrafisk har väsentligt underlättat tumör transplantation studier 6-8. Eftersom dessa djur är genetiskt identiska, transplanterade tumörceller ympas kraftigt till mottagaren fisk, och tumörtillväxt kan följas över långa tidsperioder. Syngena zebrafisk är idealiska för att begränsa utspädningen transplantation analyser i tumörceller inte behöver anpassa sig till tillväxt i en utländsk mikromiljö, vilket kan underskatta själv förnya cells frekvens 9, 10. Dessutom en cell transplantationer har genomförts framgångsrikt med syngena zebrafisk 8 och flera hundra djur kan enkelt och ekonomiskt transplanteras på en gång, som båda tjänar till att ge en mer korrekt uppskattning av själv-förnya cell frekvens.
Här är en metod presenteras för att skapa primära, fluorescerande-märkta T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) i syngena zebrafisk, och transplantera dessa tumörer till att begränsa utspädningen i vuxen fisk för att avgöra själv förnya cell frekvens. Medan leukemi tillhandahålls som ett exempel, är detta protokoll lämplig för att bestämma frekvensen av tumör-förökningsmaterial celler med hjälp av någon cancer modell i zebrafisk.
En stor styrka med hjälp av zebrafisk inom cancerforskningen är att ett stort antal djur kan användas till relativt låg kostnad. Detta är särskilt viktigt för att begränsa utspädningen analyser celltransplantation, där proportionerna av transplanterade djur som utvecklar tumörer till det totala antalet transplanterade används för att bestämma tumör-initiera cellens frekvens. I den metod som presenteras här, är över 70 transplantationer mottagaren djur som används per analys, som ger en korrekt uppskattning av tumör-sprida cell nummer. Både antalet djur som används och de doser av tumör transplanterade cellerna bör optimeras för en viss cancerform modell, till exempel om inledande experiment visar tumör-inledande celler är sällsynta, kan nyttiga transplantationen doser 100.000, 50.000, 10.000 och 1000 celler per transplantation.
Syngena zebrafisk stammar är användbara för att begränsa utspädningen analys. Men dessa stammar ännu inte vanligt förekommande i alla laboratorier, och en del zebrafisk cancer modeller finns bara i allogen fisk. Begränsa utspädningen cell transplantationer kan utföras i vildtyp stammar som genomgått immun ablation, men själv förnya celler Frekvensen kan beräknas som 10 till 100 gånger högre än om syngena zebrafisk användes 8. Det är viktigt att notera att större doser av celler som ska användas för transplantation till icke-immuna matchas, bestrålade mottagare, eftersom vissa tumörceller inte kommer att överleva transplantation till en utländsk mikromiljö. Dessutom kommer många tumörer börjar på tillbakagång efter 21 dagar när mottagaren djurets immunförsvar återhämtar sig, så djur bör bedömas för tumörtillväxt var 7 dagar efter transplantationen.
Metoderna som presenteras här är anpassade för användning med någon zebrafisk cancer modell, och har hittills använts för att bestämma tumör-initiera cell frekvens i både T-cells akut lymfatisk leukemi 8, och en solid tumör modell, rabdomyosarkom 16. Dessa tumörer har fluorescerande av samtidig injektion av embryon med både en onkogen och fluorescerande markör, eftersom DNA samarbete segregerar, kommer varje cell som manifesterar den onkogen också uttrycka det fluorescerande proteinet 17. Medan fluorescens rekommenderas eftersom det underlättar spårning av tumörtillväxt utan att behöva offra djuret och ger en rättfram sätt att isolera tumörceller med FACS, är det möjligt att märka tumörceller med antikroppar mot tumör-specifika beslutsfattare för att underlätta deras rening kan även antikroppar färgning i zebrafisk kräver optimering.
Slutligen, när förekomsten av tumör-förökningsmaterial celler har fastställts för en viss tumörtyp, är det möjligt att använda dessa analyser för att identifiera de mekanismer som styr deras cell frekvens. Till exempel kan primära tumörceller behandlas med väg specifika hämmare innan begränsa utspädning transplantation eller transplanterade fisk själva kan doseras med droger. Dessutom kan genetik tumörer sig manipuleras genom att injicera en-cells stadiet fisk med en gen, så att den resulterande primära tumörer kommer att över-uttrycker genen. I dessa försök kommer någon effekt på egen förnya celler iakttas i den begränsande utspädning analyser.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering har tillhandahållits av NIH bidrag 5T32CA09216-26 (för JSB) och K01 AR055619-01A1 och 3 K01 AR055619-03S1 (för DML), liksom av Alex Lemonade Stand-stiftelsen, Harvard Stem Cell Institute och American Cancer Samhället.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | Referências6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |