ट्यूमर प्रचार कक्ष की आवृत्ति बढ़ाता Syngeneic Zebrafish में सीमित कमजोर पड़ने सेल प्रत्यारोपण का उपयोग
Summary
सीमित कमजोर पड़ने कोशिका प्रत्यारोपण assays ट्यूमर कोशिकाओं प्रचार की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए किया जाता है. इस प्रोटोकॉल syngeneic zebrafish कि fluorescently लेबल लेकिमिया और विवरण कैसे अलग है और वयस्क zebrafish की peritoneal गुहा में सीमित कमजोर पड़ने पर इन लेकिमिया कोशिकाओं के प्रत्यारोपण विकसित पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
Abstract
Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment.
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.
Protocol
Discussion
कैंसर अनुसंधान में zebrafish का उपयोग कर के एक प्रमुख शक्ति है कि पशुओं की बड़ी संख्या अपेक्षाकृत कम लागत पर इस्तेमाल किया जा सकता है. यह कमजोर पड़ने कोशिका प्रत्यारोपण assays, जहां प्रतिरोपित जानवरों है कि प्रतिरोपित कुल संख्या के लिए ट्यूमर के विकास के अनुपात को ट्यूमर की शुरुआत सेल आवृत्ति निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है को सीमित करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यहाँ प्रस्तुत विधि में, 70 से अधिक प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता जानवरों परख के प्रति इस्तेमाल किया जाता है, ट्यूमर प्रचार सेल संख्या का सही अनुमान प्रदान. दोनों इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या और ट्यूमर प्रतिरोपित कोशिकाओं की खुराक दी कैंसर के मॉडल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, अगर प्रारंभिक प्रयोगों चलता है कि ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं दुर्लभ हैं, उपयोगी प्रत्यारोपण खुराक 100,000, १०,०००, 50,000 और 1000 प्रति कोशिकाओं किया जा सकता है प्रत्यारोपण.
Syngeneic zebrafish उपभेदों कमजोर पड़ने विश्लेषण को सीमित करने में उपयोगी होते हैं. हालांकि, इन उपभेदों अभी तक आमतौर पर सभी प्रयोगशालाओं में प्रयोग नहीं किया हैं, और कुछ zebrafish कैंसर मॉडल केवल allogenic मछली में मौजूद है. सीमित कमजोर पड़ने सेल प्रत्यारोपण कि प्रतिरक्षा पृथक आया है जंगली प्रकार उपभेदों में प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि सेल स्वयं renewing आवृत्ति 1-10 गुना की तुलना में अगर syngeneic zebrafish 8 इस्तेमाल किया गया अधिक के रूप में गणना की जा सकती है. यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि कक्षों की अधिक खुराक गैर प्रतिरक्षा मिलान विकिरणित प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि कुछ ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के एक विदेशी microenvironment में नहीं बच जाएगा. इसके अतिरिक्त, कई ट्यूमर जब प्राप्तकर्ता जानवर प्रतिरक्षा प्रणाली ठीक 21 दिन बाद निकासी शुरू करने के लिए, तो जानवरों के हर 7 दिनों के प्रत्यारोपण के बाद ट्यूमर के विकास के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
यहाँ प्रस्तुत विधियों के किसी भी zebrafish कैंसर के मॉडल के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं, और इस प्रकार अब तक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ट्यूमर दोनों टी सेल तीव्र लिम्फोब्लासटिक 8 लेकिमिया, और एक ठोस ट्यूमर मॉडल, 16 rhabdomyosarcoma में सेल आवृत्ति की शुरुआत. ये ट्यूमर fluorescently दोनों एक ओंकोजीन और फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ भ्रूण के सह इंजेक्शन द्वारा लेबल थे, क्योंकि डीएनए सह – segregates, किसी भी सेल व्यक्त ओंकोजीन भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 17 व्यक्त करेंगे . जबकि प्रतिदीप्ति की सिफारिश की है क्योंकि यह पशु बलि के लिए की आवश्यकता के बिना ट्यूमर के विकास की ट्रैकिंग की सुविधा और एक सीधे आगे FACS द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं को अलग तरीका प्रदान करता है, यह संभव है ट्यूमर विशिष्ट निर्माताओं के लिए एंटीबॉडी के साथ ट्यूमर कोशिकाओं लेबल उनकी शुद्धि की सुविधा , हालांकि zebrafish में एंटीबॉडी धुंधला अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
अंत में, एक बार ट्यूमर कोशिकाओं प्रचार की घटनाओं दिए गए ट्यूमर के प्रकार के लिए निर्धारित किया गया है, यह संभव है इन assays का उपयोग करने के लिए तंत्र है कि अपने सेल आवृत्ति सरकार की पहचान है. उदाहरण के लिए, प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से पहले कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण, या प्रतिरोपित मछली खुद को दवाओं के साथ dosed किया जा सकता है सीमित मार्ग विशिष्ट inhibitors के साथ इलाज किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, ब्याज की एक जीन के साथ एक मंच सेल मछली को इंजेक्शन लगाने के द्वारा स्वयं ट्यूमर के आनुवंशिकी चालाकी से किया जा सकता है, ताकि परिणामस्वरूप प्राथमिक ट्यूमर जीन अधिक व्यक्त करेंगे. इन प्रयोगों में, स्वयं renewing सेल आवृत्ति पर कोई प्रभाव सीमित कमजोर पड़ने assays में मनाया जाएगा.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान NIH 5T32CA09216 26 अनुदान (JSB के लिए), और K01 AR055619-01A1 और 3 K01 AR055619 03S1 (DML के लिए), के रूप में अच्छी तरह के रूप में एलेक्स नींबू पानी खड़े रहो फाउंडेशन द्वारा, हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट और अमेरिकन कैंसर द्वारा प्रदान की गई है सोसायटी.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
| Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
| Syngeneic zebrafish | Referências6-8 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
| 26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
| 40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |
Referências
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