Limitando diluição ensaios transplante de células são usadas para determinar a freqüência de tumor de células-propagação. Este protocolo descreve um método para gerar zebrafish singeneicos que desenvolvem leucemia fluorescente marcado e detalhes de como isolar e transplante dessas células de leucemia a limitar a diluição na cavidade peritoneal de peixe-zebra adulto.
Células auto-renovação de câncer são os tipos de células apenas dentro de um tumor que têm uma capacidade ilimitada para promover o crescimento do tumor, e são, portanto, conhecida como tumor de células-propagação, ou células de tumor inicial. Pensa-se que a segmentação dessas células auto-renovação de destruição irá bloquear a progressão do tumor e parar de recaídas, melhorando consideravelmente o prognóstico do paciente 1. A forma mais comum para determinar a freqüência de auto-renovação de células dentro de um tumor é uma limitação de diluição ensaio transplante de células, em que as células do tumor são transplantadas em animais receptores em doses crescentes, a proporção de animais que se desenvolvem tumores é utilizado o cálculo do número de auto-renovação de células da amostra de tumor original 2, 3. Idealmente, um grande número de animais seriam usados em cada experimento diluição limitante para determinar com precisão a freqüência de tumor de células-propagação. No entanto, experimentos de larga escala envolvendo ratos são caros, ea maioria dos ensaios de diluição limitar o uso de apenas 10-15 camundongos por experimento.
Zebrafish ganharam proeminência como um modelo de câncer, em grande parte devido à sua facilidade de manipulação genética e da economia em que experiências em grande escala pode ser realizada. Além disso, os tipos de câncer modelados em zebrafish foram encontrados para perto imitar o seu homólogo quatro doenças humanas. Embora seja possível transplantar células tumorais de um peixe para outro pela sub-letais de irradiação de animais destinatário, a regeneração do sistema imunológico após 21 dias muitas vezes provoca a regressão do tumor 5. A recente criação do peixe-zebra singeneicos facilitou enormemente estudos transplante tumor 6-8. Porque esses animais são geneticamente idênticas, transplantadas células tumorais enxertar robustamente em peixes destinatário e crescimento do tumor pode ser monitorado durante longos períodos de tempo. Singeneicos zebrafish são ideais para limitar os ensaios transplante de diluição em que as células tumorais não têm de se adaptar ao crescimento em um microambiente estrangeiros, o que pode subestimar a auto-renovação das células frequência 9, 10. Além disso, um transplante de células têm sido concluído com sucesso usando zebrafish singeneicos 8 e várias centenas de animais podem ser facilmente e economicamente transplantados de uma só vez, sendo que ambos servem para fornecer uma estimativa mais precisa de auto-renovação de frequência celulares.
Aqui, um método é apresentado para a criação primária, fluorescente marcado com T-cell leucemia aguda linfoblástica (T-ALL) em zebrafish singênico, e transplantar esses tumores de limitar a diluição em peixes adultos para determinar auto-renovação de frequência celulares. Enquanto a leucemia é fornecido como um exemplo, este protocolo é adequado para determinar a freqüência de tumor de células-propagação usando qualquer modelo de câncer no zebrafish.
A força principal de usar zebrafish na pesquisa do câncer é que um grande número de animais podem ser usados a um custo relativamente baixo. Isto é especialmente importante em limitar testes de diluição transplante de células, onde as proporções de animais transplantados que desenvolvem tumores ao número total transplantados são usados para determinar tumor de iniciação frequência celulares. No método aqui apresentado, mais de 70 animais receptores de transplante são usados por ensaio, fornecendo uma estimativa exata do tumor propagação número de células. Tanto o número de animais utilizados e as doses de células tumorais transplantadas deve ser otimizado para um modelo de câncer de dado, por exemplo, se as experiências iniciais mostram tumor de iniciação células são raras, as doses podem ser úteis transplante de 100.000, 50.000, 10.000 e 1.000 células por transplante.
Cepas singeneicos zebrafish são úteis para limitar a análise de diluição. No entanto, essas cepas ainda não são comumente usados em todos os laboratórios, e alguns modelos de zebrafish câncer só existem em peixes alogênico. Transplantes de células limitar a diluição pode ser realizado em linhagens selvagens que foram submetidos a ablação imune, embora a freqüência de auto-renovação das células pode ser calculada como 1-10 vezes maior do que se singeneicos zebrafish foram utilizadas 8. É importante notar que as doses maior de células devem ser utilizados para transplantes em não imunes combinados, os destinatários irradiados, como algumas células do tumor não sobreviverá transplante em um microambiente estrangeiros. Além disso, muitos tumores começará a regredir após 21 dias quando o sistema imunológico do animal destinatário recupera, assim que os animais devem ser avaliados para o crescimento do tumor a cada 7 dias após o transplante.
Os métodos aqui apresentados são adequados para uso com qualquer modelo de câncer de peixe-zebra, e até agora têm sido usados para determinar tumor de iniciação freqüência de células em ambas as células T leucemia linfoblástica aguda 8, e um modelo de tumor sólido, rabdomiossarcoma 16. Estes tumores foram fluorescente etiquetado por co-injeção de embriões com dois oncogene e um marcador fluorescente, porque o DNA co-segrega, qualquer célula expressando o oncogene também expressar a proteína fluorescente 17. Enquanto fluorescência é recomendado, pois facilita o rastreamento do crescimento do tumor, sem a necessidade de sacrificar o animal e fornece uma maneira simples e direta para isolar células tumorais por FACS, é possível rotular as células tumorais com anticorpos específicos para tumor fabricantes para facilitar a sua purificação , embora a coloração de anticorpos em zebrafish pode exigir de otimização.
Finalmente, uma vez que a incidência de tumor de células-propagação foi determinada para um tipo determinado tumor, é possível usar esses ensaios para identificar os mecanismos que governam a sua freqüência de células. Por exemplo, células primárias de tumor podem ser tratados com inibidores da via específica antes de limitar o transplante de diluição, ou peixe transplantado se podem ser tratados com drogas. Além disso, a genética dos tumores em si podem ser manipulados pela injeção de peixe palco de uma célula com um gene de interesse, de modo que os tumores resultantes primário sobre-expressam o gene. Nesses experimentos, qualquer efeito sobre a auto-renovação das células freqüência será observada nos ensaios de diluição limitante.
The authors have nothing to disclose.
O financiamento foi fornecido pelo NIH concede 5T32CA09216-26 (para JSB), e K01 AR055619-01A1 e 3 K01 AR055619-03S1 (para DML), bem como pelo Alex Lemonade Stand Foundation, a Harvard Stem Cell Institute ea American Cancer sociedade.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | Referências6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |