Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum
Summary
Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT (<em> Tc</em> TERT) ea reconstituição do ativo<em> T. castaneum</em> Ribonucleoproteína telomerase (RNP) complexo<em> In vitro</em>.
Abstract
Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) ea reconstituição do T. ativos telomerase castaneum ribonucleoproteína complexos (RNP) in vitro.
A telomerase é uma transcriptase reversa que adiciona uma especializados repete DNA curtas, chamadas telômeros, a extremidade 3 'dos cromossomas lineares duas que servem para protegê-los de ponta a ponta-de fusão e degradação. Após a replicação do DNA, um pequeno segmento é perdido no fim do cromossomo 3, e sem telomerase, as células continuam dividindo até que finalmente atingir o seu limite Hayflick 4. Além disso, a telomerase está adormecida na maioria das células somáticas 5 em adultos, mas é ativo em células de câncer 6, onde promove a imortalidade celular 7.
A enzima telomerase mínima consiste em dois componentes principais: a subunidade de proteína (TERT), que compreende a subunidade catalítica da enzima e um componente integrante RNA (TER), que contém o TERT modelo usa para sintetizar telômeros 8,9. Até 2008, apenas as estruturas de domínios telomerase indivíduo tinha sido resolvido 10,11. Um grande avanço neste campo veio a determinação da estrutura cristalina dos 12 ativos, subunidade catalítica de T. castaneum telomerase, Tc TERT 1.
Aqui, apresentamos métodos para produzir grandes quantidades do ativo TERT Tc, solúvel para estudos estruturais e bioquímicos, e da reconstituição do complexo RNP telomerase in vitro para ensaios de atividade telomerase. Uma visão geral dos métodos experimental utilizado é mostrado na Figura 1.
Protocol
Discussion
O método aqui apresentado permite a produção de grandes quantidades da subunidade catalítica de T. castaneum TERT telomerase na forma solúvel ativo para estudos estruturais e bioquímicos. O método de Tc TERT sobre-expressão é sensível a mudanças sutis na temperatura ou densidade celular daqueles acima mencionados e pode afetar drasticamente os níveis de expressão da proteína. Especificamente, nós descobrimos que as células para induzir a expressão da proteína antes de a densidade ópt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa apresentada aqui foi apoiado pelo departamento de Pensilvânia da saúde, o Medical Ellison, The V e As Fundações Esmeralda.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
Referências
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