Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

Summary

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

Abstract

Um objetivo fundamental tanto para a neurociência básica e clínica é compreender melhor a identidade, composição molecular e padrões de conectividade que são característicos para os neurônios do cérebro em ambos os normais e doentes. Para isso, um grande esforço foi colocado na construção de mapas de alta resolução neuroanatômicas ^1-3. Com a expansão da genética molecular e os avanços em microscopia de luz veio a capacidade de consulta não só morfologias neuronal, mas também a composição molecular e celular dos neurônios individuais e suas redes associadas ^4. Grandes avanços na capacidade de marcar e manipular neurônios através gene transgênico e tecnologias de direcionamento no roedor agora permitir que os pesquisadores subconjuntos neuronal "programa" à vontade ^5-6. Indiscutivelmente, uma das contribuições mais influentes para a neurociência contemporânea foi a descoberta e clonagem de genes que codificam proteínas fluorescentes (PQ) em invertebrados marinhos ^7-8, ao lado de seus subseqüentes de engenharia para produzir uma caixa de ferramentas cada vez maior de repórteres vital ^9. Exploração de atividade do promotor de células de tipo específico para conduzir direcionados expressão FP em discretos populações neuronais agora oferece investigações neuroanatômicas com precisão genética.

Engenharia expressão FP em neurônios melhorou muito nossa compreensão da estrutura e função cerebral. No entanto, os neurônios individuais de imagem e suas redes associadas em tecidos cerebral profunda, ou em três dimensões, manteve-se um desafio. Devido ao alto teor lipídico, o tecido nervoso é bastante opaco e apresenta fluorescência auto. Estas propriedades inerentes biofísicos dificultam a visualização e imagem neurônios fluorescente etiquetado em alta resolução através de microscopia confocal de epifluorescência ou padrão profundidades além de dezenas de microns. Para contornar este desafio investigadores muitas vezes empregam imagens seção fina de série e métodos de reconstrução ^10, ou 2-fótons de microscopia de varredura a laser ^11. Inconvenientes atuais para essas abordagens são a preparação do tecido associado de trabalho intensivo, ou de custo proibitivo de instrumentação, respectivamente.

Aqui, apresentamos um método relativamente rápido e simples de visualizar células fluorescente etiquetado na fixa semi-grossas fatias de cérebro de rato, limpando óptica e de imagem. No protocolo anexo descrevemos os métodos de: 1) o tecido cerebral fixação in situ, através de perfusão intracardíaca, 2) dissecção e remoção do cérebro inteiro, 3) a incorporação do cérebro estacionário em agarose, 4) elaboração de precisão fatia semi-grossa usando instrumentação vibratome nova , 5) o tecido cerebral de compensação através de um gradiente de glicerol, e 6) de montagem em lâminas de vidro para microscopia de luz e z-stack reconstrução (Figura 1).

Para preparar fatias de cérebro implementamos um pedaço relativamente novo de instrumentação chamado de "Compresstome" VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Este instrumento é um micrótomo semi-automatizado, equipado com um avanço motorizados e sistema de vibração da lâmina com características semelhantes em função de vibratomes outros. Ao contrário de outras vibratomes, o tecido a ser cortado é montado em um plugue de agarose dentro de um cilindro de aço inoxidável. O tecido é extrudado em espessuras desejadas do cilindro, e corte pela lâmina para a frente avançando vibrando. A ficha de agarose / sistema de cilindro permite tecido reprodutíveis de montagem, alinhamento e corte de precisão. Em nossas mãos, o "Compresstome 'rende fatias de alta qualidade de tecidos para eletrofisiologia, imuno-histoquímica, e dirigir-tecido fixo de montagem e de imagem. Combinados com a óptica, aqui demonstrar a preparação de semi-grossas fatias de cérebro fixa de alta resolução de imagem fluorescente.

Protocol

1. Na fixação do cérebro situ * Prepare uma seringa de 10 ml (28 agulha) preenchido com tampão fosfato salino (PBS). * Prepare uma seringa de 10 ml (28 agulha) preenchido com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Reserve um adicional de 50-10 ml de PFA / PBS para fixação post. Injetar por via intraperitoneal rato experimental com uma dose letal de Avertin ou Nembutal. Uma vez que o mouse está sedado, molhar o abdômen com etanol e segura o m…

Discussion

Dada a aplicação generalizada do uso de proteínas fluorescentes para atingir subconjuntos neuronal para investigação por microscopia óptica, a necessidade de rapidamente de tela, imagem, e analisar as redes neurais dentro do tecido cerebral intacto tem valor inestimável.

Avanços tecnológicos no desenvolvimento de user-friendly vetores virais, em técnicas de eletroporação in vivo, e linhagens de camundongos geneticamente modificados agora fornece uma fon…

Materials

Name of the item	Company	Catalogue number	Comments (optional)
bone scissors	F.S.T.	16044-10	-or equivalent
dissection scissors	F.S.T.	14084-08	-or equivalent
type I-B agarose	Sigma	A0576
Compresstome	Precisionary Instruments	VF-200	-other vibratomes are compatible
double sided adhesive	Grace Bio-Labs	SA-S-1L
Superfrost Plus slides	VWR	48311-703
Cover glass	VWR	48383-139
glycerol	EMD Chemicals Inc.	GX0185-6	-or equivalent