Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen
Summary
Ein<em> Ex vivo</em> Protokoll zur Erzeugung reifen menschlichen roten Blutkörperchen aus hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen beschrieben. Zusätzlich beschreiben wir eine effiziente lentivirale-Delivery-Methode Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären erythroiden Zellen. Die Effizienz der Lentivirus vermittelten Gentransfer nachgewiesen wird, mit GFP-exprimierenden Viren.
Abstract
Erythropoese ist eine häufig verwendete Modellsystem zur Untersuchung der Zelldifferenzierung. Während Erythropoese, pluripotenten adulten humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) in oligopotent Vorfahren, engagiert Vorläufern und reifen roten Blutkörperchen Zellen 1 zu unterscheiden. Dieser Prozess ist für einen großen Teil auf der Ebene der Genexpression, wobei spezifische Transkriptionsfaktoren aktivieren Linie-spezifischer Gene reguliert, während gleichzeitig unterdrücken Genen, die spezifisch für andere Zelltypen 2 sind. Studien über Transkriptionsfaktoren regulieren Erythropoese sind oft unter Verwendung von humanen und murinen Zelllinien, stellen zum Teil erythroiden Zellen zu bestimmten Stadien der Differenzierung 3-5. Allerdings transformierten Zelllinien nur teilweise imitieren erythroiden Zellen und vor allem sie nicht erlauben es, nachvollziehbar Studie der dynamischen Veränderungen, die als Zellen des Fortschritts ist möglich durch viele Stadien zu ihrer endgültigen erythroiden Schicksal. Somit bleibt eine aktuelle Herausforderung der Entwicklung eines Protokolls zu relativ homogenen Populationen von primären HSC und erythroiden Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung zu erhalten, die in Mengen, die ausreichen, Genomik und Proteomik Experimente durchzuführen sind.
Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Zellkultur-Protokoll zu erythroiden Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus entweder Nabelschnurblut, Knochenmark oder dem peripheren Blut Erwachsener mit G-CSF (Leukapherese) mobilisiert wurden, isoliert zu induzieren. Diese Kultur zeichnet sich anfänglich durch die Douay Labor 6 entwickelt, nutzt Zytokine und Co-Kultur auf mesenchymale Zellen in die Knochenmark-Mikroumgebung nachahmen. Mit dieser ex vivo Differenzierung Protokoll, beobachten wir eine starke Verstärkung von erythroiden Vorläuferzellen, eine Induktion der Differenzierung ausschließlich auf die erythroiden Linie und eine vollständige Reifung auf der Bühne des entkernten roten Blutkörperchen. So bietet dieses System die Möglichkeit, den molekularen Mechanismus der Regulation der Transkription als hämatopoetische Stammzellen Fortschritte auf dem erythroiden Linie zu studieren.
Studieren Erythropoese auf der Transkriptionsebene erfordert auch die Fähigkeit, über-express oder Knockdown spezifische Faktoren in primären erythroiden Zellen. Zu diesem Zweck verwenden wir ein Lentivirus-vermittelte Gentransfer-System, das für die effiziente Infektion von beiden Teilen und nicht teilende Zellen 7 ermöglicht. Hier zeigen wir, dass wir in der Lage, effizient Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären humanen erythroiden Zellen sind. Darüber hinaus zeigt die GFP-Expression mit einem Wirkungsgrad von lentiviralen Infektion fast 90%. So bietet unser Protokoll ein sehr nützliches System für die Charakterisierung des regulatorischen Netzwerkes von Transkriptionsfaktoren, die Steuerung der Erythropoese.
Protocol
Discussion
Eine Reihe von Methoden wurden bereits zu erythroiden Zellen in Kultur zu differenzieren mit variabler Grad von Erfolg eingesetzt. Zum Beispiel können einige Protokolle ohne Co-Kultur auf MS-5 Ausbau der erythroiden Zellen sind aber nicht in der Herstellung von voll ausgereiften entkernte rote Blutkörperchen 12-17 effizient. Während bei anderen Methoden effizienter Enukleation ermöglichen, ist es auf Kosten der Verbreitung 18,19. Die Methode, die wir hier verwendet haben, zunächst von der Doua…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken L. Douay und MC Giarratana (Université Paris VI, Frankreich) für Beratung bei der ex vivo erythroiden Differenzierung, D. Allan und H. Atkins (Ohří, Kanada) für die Bereitstellung von Blutproben (erhalten unter der Ottawa Hospital Research Ethics Board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) für die Bereitstellung der lentiviralen Vektoren und FJ Dilworth (Ohří, Kanada) für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Dieses Projekt wurde von einem CIHR gewähren (MOP-82813), um MBCGP finanziert ist ein Empfänger einer Ontario Research Fund Computational Regulomics Ausbildung Postdoktoranden-Stipendium. MB hält den Canada Research Chair in der Regulation der Genexpression.
Referências
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
- Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
- Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
- Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
- Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
- Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
- Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
- Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
- Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
- Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
- Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
- Lindern, M. v. o. n. The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
- Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
- Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
- Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
- Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
- Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).
