1. בנייה של חדר electroporation סדר microslide, BTX דגם 453 עם פער 3.2mm (Apparatus הרווארד # 45-0105) (איור 2 א). מסילות מתכת צריך להיות אטום לחלוטין אל החלק התחתון של השקופית. השתמש בכלי Dremel לחתוך את ידית מתלה microcentrifuge צינור פלסטיק. חותכים את הידית לתוך 5 חתיכות מלבני קטן עם כל הממדים הבאים: אורך 0.8cm, 0.6cm גובה, רוחב 0.3cm (איור 2B). אלו פיסות פלסטיק לשימוש חוזר מפרידי כי ישמש עובש בארות בודדים בתא microslide. הכנס את מפרידי פלסטיק בין פסי המתכת של microslide במרווחים שווים. מפרידי צריכה להתאים בנוחות (איור 2C). חותכים את קצה קצה P200 פיפטה, כדי להתאים את קצה מזרק 3ml, ולמלא את המזרק עם 100% איטום גומי סיליקון האקווריום. מלאו את הפערים בין מפרידי פלסטיק עם חומר איטום. הקפידו למלא את הפערים מלמטה למעלה, כך אין בועות טופס בין התקע איטום ובסיס microslide. מניחים על גבי מוט מתכת מפרידי פלסטיק להדק את זה עם קליפים קלסר, כך מפרידי מוחזקים במקום בעוד איטום מתייבש (איור 2D-E). בואו איטום היבש בין לילה. הסר את הסרטונים קלסר, מוט מתכת, פלסטיק מפרידי (איור 2F). השתמש בלהב סכין המנתחים כדי לנקות את איטום מעל החלק העליון של פסי מתכת. השתמש במיקרוסקופ כדי לבחון את ביתור microslide ולוודא כי אין בועות נמצאים בתחתית של סכרים סיליקון. הסר את כל הסרט איטום שאולי נוצרו בארות כזה מתכת חשופה חשוף בתוך הבארות. מילוי אחד מוכר היטב עם מים לוודא שהמים לא דליפה לתוך הבאר הסמוך (ים). חזור על הפעולה עבור כל בארות. Microslide סיים מתאים בצלחת פלסטיק עם מוטות המתכת סמוך לחלון בצד של המנה (איור 2G); את האלקטרודות יהיה בסופו של דבר להיות מחוברים מוטות המתכת. 2. ה-DNA הכנה הוסף פלסמיד דנ"א לצינור microcentrifuge 1.5mL על הקרח ולהביא את נפח עד 150μl עם מים מזוקקים. מינים פלסמיד מרובים עשוי להיות משולב עבור electroporation משותף (למשל, לבנות DsRed ניסיוניים GFP לשלוט לבנות). בחישוב את כמות ה-DNA להוסיף הצינור, יש לזכור כי נפח aliquot הסופי של ה-DNA יהיה 60μl. בדרך כלל, לבנות כל משמש בריכוז הסופי של 0.5μg/μl. להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת 15μl נתרן אצטט 3M (pH 5.2) ו – 100% אתנול 450μl. היפוך או ברז הצינור מספר פעמים כדי לערבב. ספין מטה את ה-DNA ב 4 ° C, 13,200 סל"ד, במשך 30 דקות. שטפו את הכדור עם אתנול 70%, אזי ספין אותו שוב ב 4 ° C, 13,200 סל"ד, במשך 15 דקות. אוויר יבש גלולה עד שקופה למחצה, כ -7 דקות, resuspend אז מים סטריליים 54μl. הוסף 6μl PBS 10X סטרילי (pH 7.4) ומערבבים. 3. עין אוסף לחטא את החדר electroporation וכל המכשירים עם אתנול 70%. בעוד אוסף העין לנתיחה לא צריך להתבצע במנדף בתרבית רקמה, לחטא את הכפפות שלך benchtop עם אתנול ניסיון לשמור על תנאים סטריליים לאורך ההליך. הכינו צלחות פטרי עם המדיום דיסקציה (1:1 יחס של DMEM: F12, 100U/ml לפניצילין, סטרפטומיצין 100μg/ml, 0.29mg/ml L-גלוטמין, ואינסולין 5μg/ml): שני 35mm מנות כל אחד עם בינוני 3ml אחד צלחת עם 60 מ"מ בינוני 6ml. צעד זה אמור להתבצע במנדף בתרבית רקמה. לחטא את הראש והצוואר של הרך הנולד (יום הלידה 0) עכבר הגור עם אתנול 70%. במהירות לערוף במספריים ולהעביר את הראש לצלחת 100mm סטרילית. לחתוך את הקרקפת עם מספריים קטנים לחשוף את העיניים. שימוש במלקחיים מעוקל בעדינות כדי לגרוף את העין אל מחוץ למסלול, והמקום עין בצלחת 35mm המכיל בינוני לנתיחה. זה עשוי להיות מועיל כדי להסיר את העיניים תחת מיקרוסקופ לנתח בהספק נמוך. חזור על שלבים 3.3 ו – 3.4 עד שכל העיניים כבר נאספו. לשמור את העיניים במדיום לנתיחה בטמפרטורת החדר תוך ביתור. יהיה עליך בעיניים 3-4 לכל aliquot DNA. 4. רשתית לנתיחה השימוש באתנול 70% לחטא גם סכין גילוח וגם את העטיפה של העברת פיפטה סטרילית פלסטיק. חותכים את קצה פיפטה עם להב כך שניתן להתחנף עין כולה. חנות פיפטה בעטיפה הפלסטיק כאשר אינו בשימוש. העברת עין אחת מצלחת לצלחת 35mm 60mm. תחת המיקרוסקופ לנתח בהספק גבוה, בסדר להשתמש במלקחיים כדי להסיר כל רקמות, כמו שרירים ושומן extraocular, מפני השטח של העין. לאחר מכן, להסיר את עצב הראייה על ידי צובט אותו בבסיס. על מנת לבודד את הרשתית, לתקוע חור קטן אניn בלובן העין בבית לימבוס. להוסיף אחת שיניים משני זוגות מלקחיים לתוך החור (משיק למשטח רשתית) בעדינות דמעה לפתוח את בלובן העין / הרשתית. בעכברים לבקנים, בלובן העין ועל הרשתית מופיעים יחסית מבריק לרקמת הרשתית, שהינה צבע אחיד אפור מט. בעכברים פיגמנט, הרשתית הוא שחור. השאירו את העדשה במקום. השתמש פיפטה להעביר להעביר את הרשתית גזור לתוך צלחת 35mm אחרים בינוני. חזור על שלבים 4.2-4.4 עד שכל העיניים היו גזור. אחסן את הרשתיות ב 37 ° C תרבות רקמות החממה עד שאתה מוכן electroporate. 5. הכנה electroporation הכינו מאכלים 35mm של המדיום. במשך כל aliquot DNA להיות electroporated, תצטרך צלחת אחת של המדיום לנתיחה אחד צלחת של המדיום תרבות (בינוני לנתיחה בתוספת 10% FBS). לייבל את הכלים כראוי. השתמש פיפטה P200 וסטרילי 1X PBS לשטוף את לתאי בצלחת electroporation. כל תא בעל נפח של 60 100μl. לשטוף את כל החדר שלוש פעמים. ממלאים את חדרי עם aliquots DNA. כל החדרים שאינם בשימוש צריך להיות מלא עם 60μl 1X PBS. חיבור אלקטרודות בצלחת electroporation. השתמש בהגדרות הבאות על electroporator: במצב LV, מתח, 30V, אורך הפולס, 50 msec, מספר פעימות, 5; מרווח, 950 msec, קוטביות, חד קוטבי. 6. Electroporation שימוש במלקחיים בסדר לתפוס את הרשתיות של העדשה ולהעבירם לתאי electroporation. כל תא מחזיק עד 3-4 עכבר הרשתית (איור 3). שימוש במלקחיים לקו את הרשתיות כך העדשה נשען על מוט המתכת המחובר האלקטרודה החיובית. נקו את מלקחיים עם Kimwipe לאחר העברת כל להימנע לשאת על ה-DNA מתא אחד למשנהו. לאחר כל הרשתיות מיושרים, לחץ "התחל" על electroporator. בועות זעירות צריך טופס בסרגל מתכת המחובר האלקטרודה השלילית. נתק את אלקטרודות לכבות את electroporator. שימוש במלקחיים להזיז בעדינות את הרשתיות הרחק קירות החדר. השתמש להעביר פיפטה סטרילית להעביר את הרשתיות של התאים לתוך הכלים 35mm המכיל בינוני לנתיחה. לשטוף את כל החדר שלוש פעמים עם סטרילי 1X PBS, ולאחר מכן לשטוף עם מים סטריליים. תרסיס צלחת עם אתנול 70%. 7. הצבת הרשתיות על מסנני לתרבות השתמש פיפטה להעביר להעביר את הרשתיות לתוך הכלים 35mm המכיל בינוני תרבות. לייבל בארות צלחת 6-גם סטרילי תרבות ומלא כל טוב עם בינוני תרבות 3ml. השתמש מלקחיים סטריליות למקום עגול Whatman מסננים Nuclepore, הצד המבריק למעלה, על גבי מדיום בכל טוב. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש פיפטה סטרילית להעביר להעביר את הרשתיות על המסנן, העדשה בצד למטה. אם אדמות הרשתית העדשה בצד למעלה, להרים אותו עם פיפטה ולנסות למקם אותו שוב. אין מקום יותר מ 4 הרשתיות על מסנן אחד, לוודא כי טיפות של המדיום סביב כל הרשתית להישאר נפרדים מן טיפות אחרות. שים לב כי אנו התרבות הרשתית עם העדשה ללא פגע, למרות פרוטוקולים אחרים קוראים להסרת העדשה לפני שלב זה 9. מניחים את צלחת תרבות 37 ° C רקמה תרבות חממה (5% CO 2) לגדול בסכום הרצוי של זמן, בדרך כלל שמונה ימים. מניסיוננו, שינוי המדיום הוא מיותר במהלך תקופה תרבות יום עבודה בן שמונה, למרות שינוי המדיום עשוי להידרש לתקופות תרבות יותר. 8. קציר flatmounting explants רשתית פלורסנט החלף את המדיום תרבות היטב עם כל paraformaldehyde 4% / 1X PBS. אם הרשתית נשארים תקועים עם מסננים, להשתמש במלקחיים כדי להפוך את המסננים מעל בעדינות לקלף את הרשתיות את המסנן. מדגירים את paraformaldehyde למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר. הגנו על הרשתית מן האור, כדי למנוע הלבנת את הקרינה. שוטפים את הרשתיות פעמיים במשך 10 דקות ב 1X PBS. השתמש פיפטה חד פעמי להעביר את הרשתיות לשקופית זכוכית ירידה קטנה של PBS. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, להשתמש במלקחיים כדי להפוך את הרשתית, כך הם electroporated בצד למעלה (כלומר, העדשה בצד למטה). מניחים זכוכית "רגליים" עשוי coverslips כתוש (רסיסי זכוכית על 1-2 מ"מ קוטר) בפינות של השקופית, הרגליים האלה למנוע השטחת הרשתית. הצב coverslip הזכוכית שלם על המגלשה, כך שהוא מכסה את הרשתית ואת נשענת על הרגליים. במידת הצורך, להשתמש פיפטה להוסיף PBS יותר בין השקופיות לבין coverslip. 9. הדמיה וכימות של הקרינה flatmount השתמשמיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם מצויד במצלמת מונוכרום התמונה ברשתית flatmounted על צריכת חשמל נמוכה (4X אובייקטיבי) בערוצים אדום וירוק. הרשתית חייבים להיות צילמו עם זמן חשיפה זהה עבור ערוץ פלורסנט ניתנה כדי לאפשר השוואה בין עוצמות הקרינה. ודא פיקסלים לא רוויים בתמונה כלשהי, או אחר כימות מדויק יהיה בלתי אפשרי. ייצוא תמונות בגווני אפור בפורמט TIFF. פתח את התמונה על הרשתית להגדיר אחד (כלומר .., ערוץ אדום וירוק ערוץ) ב ImageJ תוכנה ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). למען הדרכה זו, ערוץ פלואורסצנטי ירוק (GFP חלבון) היא לבנות פקד קבוע על פני כל הרשתית בניסוי. ערוץ ניאון אדום (חלבון DsRed) היא לבנות ניסיוני משתנה עבור כל קבוצה של הרשתית. התמונות צריכות להיות בגווני אפור. ב ImageJ, לבחור את התמונה לשלוט ירוק לציין מעגל של עניין עם 100 יחידות בקוטר (ניתוח / כלים / ROI מנהל / עוד / ציון). שכפל את המעגל (ROI מנהל / הוסף) כדי ליצור eight חוגים מוחלט. העבר החוגים 1-5 כדי לבחור לחמישה אזורים, כי הם electroporated אחיד, הימנעות השוליים החיצוניים של הרשתית ואת האזור שמעל העדשה (איור 4 א). כמו כן, בחר בשלושה אזורים (מעגלים 6-8) מחוץ הרשתית / עדשה כדי למדוד את הקרינה רקע. בחר את התמונה אדום, בלתי לבדוק את "Show all" תיבת ROI מנהל, מחדש את התיבה. כל שמונת מעגלי אמור להופיע בתמונה באדום. דה לבחור כל מעגל קואורדינטות מנהל ההחזר על ההשקעה. עם תמונה אדומה הנבחר, להקליט את הערך פיקסל מתכוון לכל החוגים של עניין (ROI מנהל / מדוד); מדידות 1-8 אמור להופיע שם 1-5 הם מדידות רשתית אדום 6-8 הן מדידות רקע אדום. בחר את התמונה ירוק ולהקליט את הערך פיקסל אומר: מדידות 9-16 אמור להופיע, שם הם 9-13 מדידות רשתית ירוק 14-16 הן מדידות רקע ירוק. העתק את נתוני המדידה לתוך Excel לניתוח (איור 5). ממוצע שלושת רקע המדידות הן אדומות ערוצי ירוק. הפחת הממוצע רקע אדום אחד מחמשת מדידות רשתית בערוץ אדום, לחזור לערוץ הירוק. עבור כל אינטרס אזורי של הרשתית, לחלק את הרקע מופחתים מדידה אדום על ידי מדידת-רקע ירוק מופחתים על מנת לנרמל את רמת האדום ניסיוני לרמת שליטה ירוק (איור 5). קבע את סטיית תקן ממוצע של כל המדידות מנורמל עבור לבנות DsRed נתון (למשל, 5 מדידות לכל 3 פעמים הרשתית הרשתית נפרדת). על מנת להשוות כמותית את התוצאות של electroporations ביצע בימים שונים, תמיד כוללים משקעים "רגיל" / GFP DsRed בכל סט electroporation. ערכים ביטוי יחסי על פני ניסויים ניתן להשוות ידי נרמול רמת הביטוי של זה "סטנדרטי". 10. נציג תוצאות: Electroporation תוצאות טובות ביטוי לבנות DNA (ים) על פני 1 / 4 עד 1 / 3 משטח הרשתית (איור 4 א). מאז photoreceptors מוט בפרט ביעילות transduced, טכניקה זו היא אידיאלית עבור לכימות photoreceptor ספציפי פעילות היזם (איור 4 ב). אנחנו בעבר השתמשו בגישה זו כדי לכמת מגוון של וריאנטים האמרגן של מוט ספציפי רו Gnat1 לוקוסים 10. מצאנו כי ניתן לכמת את פעילות הפרומוטר על פני טווח של פי 300 כמעט. איור 5 הוא במערך מדגם הרשתית electroporated יחיד. בדוגמה זו בפרט, ניסיוני לבנות pNrl (1.1kb)-DsRed נמדדה בערוץ אדום הבקרה לבנות pNrl (3.2kb)-GFP נמדדה בערוץ הירוק. מערך נתונים שלם עבור pNrl (1.1kb)-DsRed לבנות יכלול 6-9 הרשתיות נמדד באופן זה, וסטיית התקן יהיה מחושב על בסיס כל "DsRed מנורמל ל-GFP" ערכים. אם היינו משווים את רמת הביטוי של pNrl (1.1kb)-DsRed, למשל, pNrl (0.8kb)-DsRed, ואז בונה גם היה צריך להיות electroporated עם שליטה GFP אותו (למשל, pNrl (3.2kb) – GFP) ו צילמו במועדים חשיפה זהה. אפשר נתונים שנאספו בריכת בימים שונים אם תקן DsRed / electroporation GFP מבוצעת בכל יום (למשל, pNrl (3.2kb)-dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP). בשביל לבנות את כל ניסיוני, רמת DsRed מנורמל יהיה לאחר מכן להיות מנורמל לרמה DsRed מנורמל של "תקן" (pNrl (3.2kb)-dsRed). הטכניקה שאנו מתארים כאן הוא שימושי בעיקר עבור לכימות פעילות של צרס photoreceptor 10,13.תא מסוג פעילות ספציפית cis-הרגולציה ניתן לכמת ב נדיר סוגי תאים ברשתית כגון תאים דו קוטבית 14, אבל זה בדרך כלל דורש כי תחומי עניין לכימות להיבחר בחתכים אנכי ולא בהכנות flatmount. אותו הדבר נכון של צרס אשר כונן ביטוי סוגי תאים רבים כגון photoreceptors ותאים דו קוטבית. הפרוצדורות דומות אחרת. באיור 1. סקירה של ההליך explant רשתית electroporation. ראשית, כל העיניים מבודדים הלידה 0 גורים יום העכבר ואת הרשתית הם גזור (P1). שנית, הרשתיות ממוקמים החדרים מלאים דנ"א electroporated (P2). שלישית, הרשתיות ממוקמים על מסננים בתרבית במשך שמונה ימים (P3). רביעית, explants הרשתית הם קבועים, רכוב על שקופיות הדמיה. עוצמת הקרינה נמדדת עם ImageJ תוכנה (P4). חמישית, הנתונים ImageJ מעובדים תוכנית גיליון אלקטרוני לכמת את ההבדל בפעילות של יזמים שונים (P5). איור 2. בניית המנה electroporation. א) microslide קאמרית ללא שינוי מהרווארד Apparatus, BTX דגם 453 (קטלוג # 45-0105). ב) כלי Dremel משמש לחתוך את הידית מתלה צינור פלסטיק. הידית הוא חתך לתוך מפרידי מלבני עם הממדים הבאים: אורך 0.8cm, 0.6cm גובה, רוחב 0.3cm. ג) מפרידי הפלסטיק מותקנים לתוך תא microslide במרווחים שווים. איטום אקווריום מוזרק לתוך הפערים בין מפרידי (לא מוצג). ד) פס מתכת ממוקם מעל מפרידי. E) הבר מפרידי הם הידק לשקופית עם קליפים קלסר להחזיק הכל במקום כמו מתייבש איטום לילה. F) מפרידי יוסרו הבארות נבדקים כדי להבטיח שהם למים. G) השקופית סיים נכנס לתוך צלחת פלסטיק עם מוטות מתכת סמוך לחלון בצד של המנה. איור 3. דיאגרמה של המנה electroporation עם הרשתית. החדרים מלאים פתרונות ה-DNA (עד חמישה פתרונות שונים בכל פעם). הרשתיות ממוקמים בתאי בכיוון כך העדשה נשען על מוט המתכת המחובר האלקטרודה החיובית, שלושה או ארבעה הרשתיות יתאים כל אחד מחמשת החדרים. זרם חשמלי יגרום מולקולות דנ"א שלילי טעון להעביר לתאי הרשתית. איור 4.) ImageJ מדידת רמות הקרינה רשתית ב flatmount. תמונות בגווני אפור flatmount ב DsRed (ניסיוניים) ו-GFP (שליטה) הערוצים נפתחים בתוכנה ImageJ; לציין כי תמונות אלה היו בצבע לצורכי המחשה בלבד. חמישה מעגלים מדידה (1 עד 5) ממוקמות מעל אזורים electroporated אחיד, הימנעות בקצוות העדשה (קווים מקווקווים). שלושה עיגולים מדידה (6 עד 8) ממוקמות מחוץ הרשתית על מנת לקבוע את רמות הקרינה רקע. ב) חתך תמונות של explant רשתית electroporated בהספק גבוה. Explant היה קבוע יום לאחר הלידה 8, cryoprotected ב 30% sucrose/1X PBS לילה ב 4 ° C, מוטבע אוקטובר, ו cryo-מחולק ב 12μm. בונה פלורסנט pNrl (1.1kb) ו-DsRed pNrl (3.2kb)-GFP באים לידי ביטוי בתאים photoreceptor בשכבה החיצונית גרעיני (ONL). שכבת INL, הגרעין הפנימי; GCL, תא שכבת גנגליון. איור 5. עיבוד נתונים הקרינה באמצעות Excel. בשלב 1, הערך הממוצע של פיקסל כל מעגל מדידה מועתק לתוך הגיליון האלקטרוני (תאים B3, B12, F3, F5, H3-H5). מדידות # 1-5 הם הערכים רשתית DsRed ו # 6-8 הם הערכים רקע DsRed; מדידות # 9-13 הם ערכי ה-GFP הרשתית # 14-16 הם הערכים רקע GFP. שים לב מדידה # 1 # 9 מתאימות מעגל המדידה זהה, וכך גם המידות # 2 ו – # 10, וכן הלאה. בשלב 2, ערך את הרקע הממוצע עבור ערוצי DsRed ו-GFP מחושב (תאים F6, H6). בשלב 3, על רקע ממוצע מופחת מדידה כל רשתית (בתאים C3-C12). בשלב 4, כל הרקע מופחתים מדידה DsRed הוא מנורמל למדידת GFP המתאימה (בתאים D3-D7).