Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

Summary

Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.

Abstract

Stem en tumor celbiologie studies vereisen vaak virale transductie van menselijke cellen met bekende of vermoedelijke oncogenen, het verhogen van de belangrijkste veiligheidsproblemen voor laboratorium personeel. Pantropic lentivirussen, zoals de veelgebruikte VSV-G pseudotype, zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van genen de functie omdat ze transduceren vele soorten cellen, waaronder niet-delende cellen. Echter, kunnen onderzoekers willen de productie en centrifugeren van pantropic virussen coderen oncogenen als gevolg van hogere bioveiligheidsniveau handling-eisen en veiligheid te voorkomen. Een aantal krachtige oncogenen, zoals c-Myc en SV40 grote T antigen, is bekend dat de productie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) te verbeteren. Alle andere bekende IPSC-inducerende genetische veranderingen (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, en p53 verlies van functie) hebben ook links naar kanker, waardoor ze van de relatief hoge veiligheid zorg ook.

Hoewel deze kanker-gerelateerde virussen zijn nuttig in het bestuderen van cellulaire herprogrammering en pluripotentie, moeten ze veilig gebruikt worden. Om deze problemen bioveiligheid, demonstreren we een methode voor de transductie van menselijke cellen met ecotropic lentivirus, met extra nadruk op de lagere kosten en comfortabele bediening. Wij hebben ecotropic lentivirus met een voldoende hoge titer tot meer dan 90% van de transduceren receptor-expressie menselijke cellen blootgesteld aan het virus, het valideren van de effectiviteit van deze aanpak.

Lentivirus wordt vaak geconcentreerd door ultracentrifugatie, maar dit proces duurt enkele uren en kunnen produceren aërosolen besmettelijk voor de mens biomedische onderzoekers. Als alternatief, virale deeltjes kunnen meer veilig gesedimenteerd op cellen door complexvorming met chondroïtine sulfaat en polybreen (CS / PB). Deze techniek verhoogt de functionele virale titer tot 3-voudig in cellen die stabiel uitdrukken muriene retrovirus receptor, met een verwaarloosbare extra tijd en kosten. Transductie van menselijke dermale fibroblasten (HDFS) is maximaal verbeterd met behulp van CS / PB concentraties van ongeveer 4-maal lager dan de optimale waarde die eerder gerapporteerd voor kanker cellijnen, wat suggereert dat polymeerconcentratie moet worden getitreerd voor het doel celtype van belang. Wij zijn dan ook beschrijven het gebruik van methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) voor het testen van toxiciteit voor het polymeer in een nieuwe cel type. We observeren equivalent leefbaarheid van HDFS na het virale transductie met behulp van polymeer complexering of de standaard dosis van polybreen (PB, 6 ug / ml), wat aangeeft een minimale acute toxiciteit.

In dit protocol beschrijven we het gebruik van ecotropic lentivirus voor overexpressie van oncogenen in menselijke cellen, het verminderen van bioveiligheid risico's en het verhogen van de transductie tarief. We tonen ook aan het gebruik van polymeer complexatie aan transductie te verbeteren terwijl het vermijden van aërosolvormende centrifugeren van virale deeltjes.

Protocol

1. Lentivirus production, harvest, and freezing Consult your institutional safety official before beginning this protocol, and follow their recommended safety guidelines. Day 1. Start with healthy, rapidly growing 293T cells to produce virus. Plate the cells at 5 x 106 cells per 10 cm plate. Use antibiotic-free 293T medium (high-glucose DMEM with 10% FBS and 4 mM L-glutamine) for virus production. Day 2. In the late afternoon, transfect 293T cells as follows (numbers given are for one 10 cm plate). Let all reagents warm up to room temperature. Pipette 375 μl OptiMEM into a microcentrifuge tube, then add 25 μl Fugene HD. Do not allow undiluted Fugene to contact the surface of the tube. In a microcentrifuge tube, mix: 5 μg transfer plasmid (Slc7a1, target vector, or fluorescent control vector) 3.75 μg packaging plasmid (pCMV-dR8.91 or psPax2) 1.25 μg envelope plasmid (pMD2.G for pantropic, pHCMV-EcoEnv for ecotropic) serum-free OptiMEM to 100 μl Combine the two tubes and incubate the mixture 20-30 minutes at room temperature. Change the medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Add the Fugene/plasmid mix drop-wise to the plate and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. Day 3. Change medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Be gentle, because 293T cells adhere only loosely and can slough off by media pipetted too forcefully onto the monolayer. Incubate for two days in a humidified incubator for virus production. Day 5. Harvest virus and filter with a 0.45 mm low protein binding filter. Use immediately or dispense into single-use aliquots and freeze at -80°C. Frozen pantropic and ecotropic virus should be re-titered after it has been stored for six months and one month, respectively. Titer the virus as follows, using cells that are relatively amenable to transduction. Transduce cells with fluorescent control virus overnight using serial dilutions (e.g. 1:10, 1:100, 1:1000) in fresh medium with 6 μg/ml PB. Change to fresh medium the next day. Allow the cells two days after transduction to begin expressing the fluorescent protein, then determine the fraction of transduced cells by FACS. Calculate the titer in transforming units (TU) per ml, based on dilutions that yield < 15% transduction to minimize multiple transduction events. 2. Transduction of human target cells with murine retrovirus receptor Slc7a1 Select a multiplicity of infection (MOI) = 2 to ensure that most cells will be transduced. For target cells that are resistant to transduction such as HDFs, a higher MOI will be required; we dilute the viral supernatant only 1:2 to achieve transduction of a majority of the cells. Transduce target cells overnight with viral supernatant diluted in fresh culture medium with 6 μg/ml PB, which increases transduction by enhancing electrostatic interaction between the virus and target cell.1 Ideally one should use a minimal volume of virus, such as 1 ml for a 35 mm plate, because diffusion is a limiting factor in transduction efficiency. Culture cells for at least 48 hours after removing virus before transducing them with ecotropic virus, in order to ensure sufficient expression of the Slc7a1 receptor. (Optional) It is possible to use blasticidin to select for stably transduced cells expressing Slc7a1, if desired. A blasticidin kill curve should be generated in advance to determine the lowest effective concentration, generally between 2 – 10 μg/ml, that kills all untransduced target cells in 7 days. About 2 days after removing the Slc7a1 virus, switch the transduced cells to medium containing blasticidin. Culture the cells in blasticidin-containing medium for 7 days, at which point all remaining cells will stably express the retrovirus receptor at which point they can be transduced with ecotropic virus as well as banked for future use as a stable Slc7a1-expressing line. 3. Polymer complex titration to determine toxicity Day 1. Plate cells at 5000 cells/well in a 96-well plate, allowing at least triplicate wells for each experimental group. Include untransduced cells in complete medium to provide a baseline value for healthy cells, as well as samples consisting of cells in serum-free medium to induce growth arrest as a control. In parallel, plate cells in an appropriate format (such as a 24-well plate) for microscopic or FACS-based analysis of transduction efficiency in each experimental condition. Day 2. Transduce cells in plates set up for both the MTT and FACS analyses with virus encoding GFP, at an MOI of 0.5 to transduce ~40% of target cells. Test varied concentrations of CS/PB (e.g. 50, 100, 200, 400, 600, and 800 mg/ml of each component), as well as 6 μg/ml PB, to determine optimal amounts. Generate polymer complexes as described in Part 4, below. Day 3. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. Return the plates to a humidified incubator. Day 5. Analyze FACS plate to determine the transduction efficiency with each polymer concentration. Day 6. Remove the medium from all wells of the MTT plate and replace with 100 μl MTT solution (1 mg/ml MTT in complete medium). Culture for three hours in a humidified incubator to allow MTT to be reduced in the mitochondria of metabolically active cells. Remove MTT solution and replace with 200 ml MTT solvent (0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 in isopropanol). Incubate for two hours at room temperature or until all of the purple MTT formazan precipitate is dissolved. Read the absorbance on a microplate reader at 570 nm, subtracting the background reading at 690 nm. Select the optimal polymer concentration that produces maximum enhancement of transduction, as determined by FACS, with minimal effect on metabolic activity, as determined by MTT. For HDFs, we selected 100 μg/ml CS/PB based on the data shown in the Representative Results, below. 4. Ecotropic transduction with polymer complexation Prepare sterile-filtered stock solutions of PB and chondroitin sulfate at 20 mg/ml in water. Aliquot and store at -20°C. Pipette viral supernatant into a microcentrifuge tube and dilute to the desired final concentration (e.g. MOI of 2) with fresh culture medium. Add equal volumes of PB and chondroitin sulfate (concentrations determined in step 3 above) in succession, flicking the tube to mix after each addition. The viral mixture will immediately become cloudy as precipitates form. Incubate the viral mixture at room temperature for 5 minutes to allow complex formation. Remove media from the receptor-expressing target cells, replace with the viral mix, and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. After removing the viral mix, wash the surface of the cells twice with PBS to aid in removing viral complexes. Complete removal is not necessary; we have observed no adverse effects on cell health from residual polymer complexes. 5. Verifying specificity of ecotropic transduction When producing ecotropic virus for the first time, it is prudent from a safety perspective to verify that the virus is unable to transduce unmodified human cells. Transduce human cells with ecotropic lentivirus at relatively high concentration (only a 1 to 2-fold dilution of viral supernatant in fresh medium) overnight with 6 μg/ml PB or optimized CS/PB concentration. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. After incubating cells for 2 days, validate transgene expression by FACS using fluorescent vectors and/or by RT-PCR with transgene-specific primers. 6. Representative results: Fig. 1A shows the lentivirus production process, and Fig. 1B shows transduction of human cells with ecotropic lentivirus, including pre-transduction with murine retrovirus receptor Slc7a1. For titering virus, we use a human rhabdomyosarcoma cell line stably transduced with Slc7a1 (Slc-hRMS). When using fluorescent control vectors to monitor transduction efficiency, we routinely achieve > 90% transduction efficiency of Slc-hRMS with ecotropic virus, as shown in Fig. 2A and 2B. Transduction rates of HDFs are generally lower because the cells have not been blasticidin-selected for receptor expression (Fig. 2C). Titers of ecotropic lentivirus are generally 10-20% of VSV-pseudotyped virus when measured on Slc-hRMS (Fig. 2D). One freeze-thaw cycle reduces titer of ecotropic virus by 16 – 3%, equal to titer loss during a single freeze-thaw cycle of VSV-pseudotyped virus (p > 0.05). Contrary to previous reports,2 we observe no positive effect on virus titer from flash freezing in dry ice. Rather, we achieve higher post-thaw titers of either pseudotype by simply placing tubes of virus into a -80°C freezer (data not shown). The MTT viability assay allows sensitive detection of growth arrest in target cells. Transduction with virus plus concentrations of CS/PB up to 800 μg/ml has no effect on HDF metabolism (Fig. 3A). Exposure to CS/PB without virus also has no toxic effect on cells (data not shown). FACS analysis of HDFs transduced with virus plus various concentrations of CS/PB shows enhancement of transduction compared to PB alone (Fig. 3B). The maximum enhancement occurs at 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), several-fold lower than previously reported values.3 Thus, it is important to optimize conditions for any given target cell type. Complexation with CS/PB enhances the observed titer roughly 3-fold in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0.01). In practice, this yields a greater effect on transduction efficiency at low virus concentrations than at higher concentrations (Fig. 4B), which is most likely due to multiply transduced cells and receptor saturation at higher virus concentrations. Transduction with ecotropic virus is specific for cells expressing murine retrovirus receptor. When transducing unmodified human cells with ecotropic virus, we have not observed fluorescence greater than the untransduced background whether using PB or CS/PB, as shown in Fig. 5A. Microscopically, HDFs show no transduction in the absence of receptor (Fig. 5B) while pre-transduction with receptor results in fluorescent cells (Fig. 5C). Figure 1. Schematic view of (A) the virus production process and (B) transduction of human cells with murine retrovirus receptor followed by ecotropic lentivirus. Figure 2. High-efficiency transduction of human cells with ecotropic lentivirus encoding GFP. Cells were pre-transduced with murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) Human rhabdomyosarcoma cell line blasticidin-selected for Slc7a1 (Slc-hRMS), transduced (blue) or untransduced (pink) with GFP. (B) Fluorescent micrograph of ecotropic-transduced Slc-hRMS (4X). (C) HDFs transduced (blue) and untransduced (pink) with ecotropic GFP lentivirus; cells were transduced with Slc7a1 two days prior to ecotropic transduction. (D) Titer of VSV-G pseudotyped and ecotropic lentivirus, measured on Slc-hRMS. Figure 3. Optimizing chondroitin sulfate/polybrene (CS/PB) concentrations in human dermal fibroblasts. (A) Viability of HDFs measured by MTT assay after transduction in the presence of PB only or with varied concentrations of CS/PB. (B) Enhancement of transduction efficiency in HDFs by different concentrations of CS/PB, measured by FACS. (C) Quantification of transduction enhancement, showing that maximum transduction occurs at 100 μg/ml CS/PB. Figure 4. Effect of 400 μg/ml CS/PB on transduction of Slc-hRMS with ecotropic lentivirus. (A) Titer enhancement, and (B) fold change in transduction rate compared to 6 μg/ml polybrene alone. Figure 5. Lack of ecotropic transduction of HDFs in the absence of murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) FACS plot of BJ human fibroblasts, untransduced (pink) or transduced (blue) with ecotropic GFP lentivirus in both cases in the absence of receptor Slc7a1. BJ human fibroblasts transduced with ecotropic GFP lentivirus, without (B) and with (C) pre-transduction with receptor Slc7a1 (4X).

Discussion

Recombinant ecotropic gammaretrovirus gebaseerd op Moloney murine leukemia virus (MLV) en zijn receptor mSlc7a1 zijn goed bestudeerd en op grote schaal beschikbaar, die al meer dan 20 jaar transgenen te leveren aan muizen cellen. Ecotropic gammaretrovirus is ook meer recent gebruikt om oncogenen te leveren aan menselijke cellen,. In het kader van cellulaire herprogrammering, het gebruik van mSlc7a1 op generatie van amfotrope virus herbergen menselijke oncogenen te voorkomen is goed ingeburgerd maar ^4,5, lentivirus biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van gammaretrovirus in transduceren vuurvaste celpopulaties, ⁶ inclusief primaire cellen die vaak gewenst zijn doelen voor herprogrammering, omdat de lentivirale pre-integratie complex maakt transductie van niet-delende cellen. ⁷

Lentivirussen zijn geproduceerd met tientallen verschillende pseudotypes, waaronder MLV, in een poging om virus tropisme, toxiciteit en andere eigenschappen. ⁸ MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus is gebruikt om muizen cellen, ⁹ transduceren maar is zelden gebruikt op menselijke cellen te veranderen ^10. Daarom het gebruik van de MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus te stellen als een veilige, kosteneffectieve en zeer efficiënte voertuig bekend is of vermoed oncogenen, met inbegrip van cellulaire herprogrammering factoren, te leveren aan menselijke cellen.

Het is van cruciaal belang op te merken dat dit protocol niet helemaal de noodzaak om te produceren en te gebruiken pantropic lentivirus te elimineren, maar eerder dit protocol scheidt het oncogen (s) van de pantropic virus, isolerende onderzoekers van potentiële self-inoculatie met kanker-gerelateerde virussen. Het eiwit mSlc7a1 en haar menselijke homoloog hSlc7a1 zijn alom uitgedrukt aminozuur transporteurs zonder bekende tumorgeniciteit of het vermogen om een selectieve groei voordeel op ontvangende cellen, waardoor ¹¹ mSlc7a1 van een relatief laag risico voor opname in amfotrope virus. Deze extra stap kan met name nuttig zijn in laboratoria ontbreken gewijd virus of weefselkweek faciliteiten van het vereiste niveau van bioveiligheid.

In sommige situaties kan het mogelijk zijn om volledig te elimineren van het gebruik van pantropic virus door het transfecteren van de Slc7a1 plasmide direct in doelcellen, maar veel cellen die nuttig zouden zijn doelwit van deze techniek zijn ook ongevoelig zijn voor transfectie. Als alternatief, de mogelijkheid om te isoleren Slc7a1-getransduceerde cellen door blasticidine selectie houdt in dat VSV-G pseudogetypeerde lentivirus kan eenmaal worden gebruikt om een ​​voorraad van receptor-expressie cellen, waarna ecotropic virus routinematig gebruikt kunnen worden om deze cellen transduceren voor velen te genereren experimenten. Onderzoekers moeten altijd volgen hun institutionele veiligheid van richtlijnen voor het werken met een lentivirus, ongeacht de tropisme.

Titers van ecotropic virus bereikt met dit protocol zijn matig lager zijn dan VSV-virus pseudogetypeerde, over het algemeen 10-20% van de pantropic virus titer, in overeenstemming met eerdere studies. ^Negen Deze titers werden gemeten in menselijke cellen stabiel getransduceerd met Slc7a1, zodat de lagere waargenomen titer voor ecotropic virus kan gedeeltelijk te wijten aan verschillende expressie van de receptor-gen in target cellen. Niettemin, de virale titers bereikt in ons protocol zijn meer dan voldoende voor de meeste toepassingen en leiden tot transductie van de meerderheid van de cellen, in sommige gevallen> 90% van de cellen.

Centrifugatie-gebaseerde technieken worden vaak gebruikt om virale deeltjes concentreren. Echter, centrifugeren vereist verscheidene uren, genereert infectieuze aërosolen kunnen voortbrengen, en kan resulteren in een significant verlies van virale deeltjes. ¹² Als een alternatief, complexatie met CS / PB kan worden gebruikt om transductie te verbeteren zonder dat virale tropisme. ³ Deze methode is snel (5 minuten ) en goedkoop ($ 0,03 per 10 ml virus), terwijl ongeveer een verdrievoudiging van de waargenomen titer. Geen speciale uitrusting of merkgebonden reagentia nodig zijn, en zagen we een minimale acute toxiciteit na blootstelling van HDFS aan CS / PB, in overeenstemming met eerder werk in andere cellijnen. ¹³ Een potentieel nadeel van dit protocol is dat een aantal microscopisch zichtbare polymeer complexen zich te houden aan de cellen voor meerdere dagen in de cultuur. We kunnen niet uitsluiten dat deze complexen, maar niet openlijk toxisch voor de cellen, kan meer subtiele effecten op cellulaire processen.

Hier hebben we beschreven een methode voor het veilig en efficiënt transducerende menselijke cellen met oncogene factoren. Deze aanpak moet worden van groot nut voor onderzoekers bestuderen van oncogenen en stamcelbiologie inclusief iPS cellen.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murine MLV receptor
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G envelope
pCMV-dR8.91	D. Trono lab14		Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic envelope
FUGW	Addgene	14883	GFP control plasmid
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Fisher	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021