Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité

Summary

Les lentivirus sont un précieux outil de recherche pour explorer la fonction des gènes, mais les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production de l'encodage des lentivirus pantropique connus ou soupçonnés oncogènes. Comme alternative, nous présentons un protocole de sécurité pour l'utilisation de lentivirus écotrope sur des cellules humaines modifiées pour exprimer des récepteurs mSlc7a1 écotrope.

Abstract

Des études souches et la biologie des cellules tumorales ont souvent besoin de transduction virale des cellules humaines avec des oncogènes connus ou suspectés, soulevant des questions de sécurité majeur pour le personnel de laboratoire. Lentivirus pantropique, comme le couramment utilisé VSV-G pseudotype, sont un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, car ils peuvent transduire nombreux types cellulaires, y compris les cellules ne se divisent pas. Cependant, les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production et la centrifugation de virus oncogènes pantropique encodage raison de la hausse des exigences de biosécurité de niveau et de manipulation des questions de sécurité. Plusieurs oncogènes puissants, y compris c-Myc et antigène T de SV40 grandes, sont connus pour augmenter la production de cellules souches pluripotentes induites (COPSi). Tous les autres connus iPSC induisant des modifications génétiques (Oct4, Sox2, KLF4, NANOG, LIN28, et la perte de fonction de p53) ont également des liens vers le cancer, les rendant de préoccupation de sécurité relativement élevé ainsi.

Bien que ces virus liés au cancer sont utiles dans l'étude de la reprogrammation cellulaire et de pluripotence, ils doivent être utilisés en toute sécurité. Pour répondre à ces questions de biosécurité, nous démontrons une méthode pour la transduction des cellules humaines avec des lentivirus écotrope, avec un accent supplémentaire sur un coût réduit et manipulation aisée. Nous avons produit des lentivirus écotrope avec titre suffisamment élevé pour transduire supérieure à 90% de cellules exprimant le récepteur humain exposé au virus, de valider l'efficacité de cette approche.

Lentivirus est souvent concentrés par ultracentrifugation; cependant, ce processus prend plusieurs heures et peuvent produire des aérosols infectieux à l'homme les chercheurs biomédicaux. Comme alternative, les particules virales peuvent être de manière plus sûre sur les cellules sédimentées par complexation avec le sulfate de chondroïtine et de polybrène (CS / PB). Cette technique augmente le titre fonctionnelle virale jusqu'à 3 fois dans des cellules exprimant de façon stable des récepteurs rétrovirus murin, avec le temps et le coût ajouté négligeables. La transduction des fibroblastes dermiques humains (HDFS) est améliorée en utilisant au maximum CS / PB concentrations d'environ 4 fois inférieure à la valeur optimale antérieurement pour des lignées cellulaires cancéreuses, ce qui suggère que la concentration du polymère doit être adaptée pour le type de cellules cibles d'intérêt. Nous avons donc décrire l'utilisation du bromure de tétrazolium-methylthiazolyldiphenyl (MTT) pour le dosage de la toxicité de polymère dans un type de cellules nouvelles. Nous observons la viabilité équivalent de HDFS après transduction virale en utilisant soit la complexation polymère ou la dose standard de polybrène (PB, 6 pg / ml), indiquant un minimum de toxicité aiguë.

Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de lentivirus écotrope de la surexpression d'oncogènes dans les cellules humaines, la réduction des risques de biosécurité et d'augmenter le taux de transduction. Nous démontrons également l'utilisation de polymères pour améliorer la complexation transduction tout en évitant les aérosols formant centrifugation des particules virales.

Protocol

1. Lentivirus production, harvest, and freezing Consult your institutional safety official before beginning this protocol, and follow their recommended safety guidelines. Day 1. Start with healthy, rapidly growing 293T cells to produce virus. Plate the cells at 5 x 106 cells per 10 cm plate. Use antibiotic-free 293T medium (high-glucose DMEM with 10% FBS and 4 mM L-glutamine) for virus production. Day 2. In the late afternoon, transfect 293T cells as follows (numbers given are for one 10 cm plate). Let all reagents warm up to room temperature. Pipette 375 μl OptiMEM into a microcentrifuge tube, then add 25 μl Fugene HD. Do not allow undiluted Fugene to contact the surface of the tube. In a microcentrifuge tube, mix: 5 μg transfer plasmid (Slc7a1, target vector, or fluorescent control vector) 3.75 μg packaging plasmid (pCMV-dR8.91 or psPax2) 1.25 μg envelope plasmid (pMD2.G for pantropic, pHCMV-EcoEnv for ecotropic) serum-free OptiMEM to 100 μl Combine the two tubes and incubate the mixture 20-30 minutes at room temperature. Change the medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Add the Fugene/plasmid mix drop-wise to the plate and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. Day 3. Change medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Be gentle, because 293T cells adhere only loosely and can slough off by media pipetted too forcefully onto the monolayer. Incubate for two days in a humidified incubator for virus production. Day 5. Harvest virus and filter with a 0.45 mm low protein binding filter. Use immediately or dispense into single-use aliquots and freeze at -80°C. Frozen pantropic and ecotropic virus should be re-titered after it has been stored for six months and one month, respectively. Titer the virus as follows, using cells that are relatively amenable to transduction. Transduce cells with fluorescent control virus overnight using serial dilutions (e.g. 1:10, 1:100, 1:1000) in fresh medium with 6 μg/ml PB. Change to fresh medium the next day. Allow the cells two days after transduction to begin expressing the fluorescent protein, then determine the fraction of transduced cells by FACS. Calculate the titer in transforming units (TU) per ml, based on dilutions that yield < 15% transduction to minimize multiple transduction events. 2. Transduction of human target cells with murine retrovirus receptor Slc7a1 Select a multiplicity of infection (MOI) = 2 to ensure that most cells will be transduced. For target cells that are resistant to transduction such as HDFs, a higher MOI will be required; we dilute the viral supernatant only 1:2 to achieve transduction of a majority of the cells. Transduce target cells overnight with viral supernatant diluted in fresh culture medium with 6 μg/ml PB, which increases transduction by enhancing electrostatic interaction between the virus and target cell.1 Ideally one should use a minimal volume of virus, such as 1 ml for a 35 mm plate, because diffusion is a limiting factor in transduction efficiency. Culture cells for at least 48 hours after removing virus before transducing them with ecotropic virus, in order to ensure sufficient expression of the Slc7a1 receptor. (Optional) It is possible to use blasticidin to select for stably transduced cells expressing Slc7a1, if desired. A blasticidin kill curve should be generated in advance to determine the lowest effective concentration, generally between 2 – 10 μg/ml, that kills all untransduced target cells in 7 days. About 2 days after removing the Slc7a1 virus, switch the transduced cells to medium containing blasticidin. Culture the cells in blasticidin-containing medium for 7 days, at which point all remaining cells will stably express the retrovirus receptor at which point they can be transduced with ecotropic virus as well as banked for future use as a stable Slc7a1-expressing line. 3. Polymer complex titration to determine toxicity Day 1. Plate cells at 5000 cells/well in a 96-well plate, allowing at least triplicate wells for each experimental group. Include untransduced cells in complete medium to provide a baseline value for healthy cells, as well as samples consisting of cells in serum-free medium to induce growth arrest as a control. In parallel, plate cells in an appropriate format (such as a 24-well plate) for microscopic or FACS-based analysis of transduction efficiency in each experimental condition. Day 2. Transduce cells in plates set up for both the MTT and FACS analyses with virus encoding GFP, at an MOI of 0.5 to transduce ~40% of target cells. Test varied concentrations of CS/PB (e.g. 50, 100, 200, 400, 600, and 800 mg/ml of each component), as well as 6 μg/ml PB, to determine optimal amounts. Generate polymer complexes as described in Part 4, below. Day 3. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. Return the plates to a humidified incubator. Day 5. Analyze FACS plate to determine the transduction efficiency with each polymer concentration. Day 6. Remove the medium from all wells of the MTT plate and replace with 100 μl MTT solution (1 mg/ml MTT in complete medium). Culture for three hours in a humidified incubator to allow MTT to be reduced in the mitochondria of metabolically active cells. Remove MTT solution and replace with 200 ml MTT solvent (0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 in isopropanol). Incubate for two hours at room temperature or until all of the purple MTT formazan precipitate is dissolved. Read the absorbance on a microplate reader at 570 nm, subtracting the background reading at 690 nm. Select the optimal polymer concentration that produces maximum enhancement of transduction, as determined by FACS, with minimal effect on metabolic activity, as determined by MTT. For HDFs, we selected 100 μg/ml CS/PB based on the data shown in the Representative Results, below. 4. Ecotropic transduction with polymer complexation Prepare sterile-filtered stock solutions of PB and chondroitin sulfate at 20 mg/ml in water. Aliquot and store at -20°C. Pipette viral supernatant into a microcentrifuge tube and dilute to the desired final concentration (e.g. MOI of 2) with fresh culture medium. Add equal volumes of PB and chondroitin sulfate (concentrations determined in step 3 above) in succession, flicking the tube to mix after each addition. The viral mixture will immediately become cloudy as precipitates form. Incubate the viral mixture at room temperature for 5 minutes to allow complex formation. Remove media from the receptor-expressing target cells, replace with the viral mix, and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. After removing the viral mix, wash the surface of the cells twice with PBS to aid in removing viral complexes. Complete removal is not necessary; we have observed no adverse effects on cell health from residual polymer complexes. 5. Verifying specificity of ecotropic transduction When producing ecotropic virus for the first time, it is prudent from a safety perspective to verify that the virus is unable to transduce unmodified human cells. Transduce human cells with ecotropic lentivirus at relatively high concentration (only a 1 to 2-fold dilution of viral supernatant in fresh medium) overnight with 6 μg/ml PB or optimized CS/PB concentration. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. After incubating cells for 2 days, validate transgene expression by FACS using fluorescent vectors and/or by RT-PCR with transgene-specific primers. 6. Representative results: Fig. 1A shows the lentivirus production process, and Fig. 1B shows transduction of human cells with ecotropic lentivirus, including pre-transduction with murine retrovirus receptor Slc7a1. For titering virus, we use a human rhabdomyosarcoma cell line stably transduced with Slc7a1 (Slc-hRMS). When using fluorescent control vectors to monitor transduction efficiency, we routinely achieve > 90% transduction efficiency of Slc-hRMS with ecotropic virus, as shown in Fig. 2A and 2B. Transduction rates of HDFs are generally lower because the cells have not been blasticidin-selected for receptor expression (Fig. 2C). Titers of ecotropic lentivirus are generally 10-20% of VSV-pseudotyped virus when measured on Slc-hRMS (Fig. 2D). One freeze-thaw cycle reduces titer of ecotropic virus by 16 – 3%, equal to titer loss during a single freeze-thaw cycle of VSV-pseudotyped virus (p > 0.05). Contrary to previous reports,2 we observe no positive effect on virus titer from flash freezing in dry ice. Rather, we achieve higher post-thaw titers of either pseudotype by simply placing tubes of virus into a -80°C freezer (data not shown). The MTT viability assay allows sensitive detection of growth arrest in target cells. Transduction with virus plus concentrations of CS/PB up to 800 μg/ml has no effect on HDF metabolism (Fig. 3A). Exposure to CS/PB without virus also has no toxic effect on cells (data not shown). FACS analysis of HDFs transduced with virus plus various concentrations of CS/PB shows enhancement of transduction compared to PB alone (Fig. 3B). The maximum enhancement occurs at 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), several-fold lower than previously reported values.3 Thus, it is important to optimize conditions for any given target cell type. Complexation with CS/PB enhances the observed titer roughly 3-fold in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0.01). In practice, this yields a greater effect on transduction efficiency at low virus concentrations than at higher concentrations (Fig. 4B), which is most likely due to multiply transduced cells and receptor saturation at higher virus concentrations. Transduction with ecotropic virus is specific for cells expressing murine retrovirus receptor. When transducing unmodified human cells with ecotropic virus, we have not observed fluorescence greater than the untransduced background whether using PB or CS/PB, as shown in Fig. 5A. Microscopically, HDFs show no transduction in the absence of receptor (Fig. 5B) while pre-transduction with receptor results in fluorescent cells (Fig. 5C). Figure 1. Schematic view of (A) the virus production process and (B) transduction of human cells with murine retrovirus receptor followed by ecotropic lentivirus. Figure 2. High-efficiency transduction of human cells with ecotropic lentivirus encoding GFP. Cells were pre-transduced with murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) Human rhabdomyosarcoma cell line blasticidin-selected for Slc7a1 (Slc-hRMS), transduced (blue) or untransduced (pink) with GFP. (B) Fluorescent micrograph of ecotropic-transduced Slc-hRMS (4X). (C) HDFs transduced (blue) and untransduced (pink) with ecotropic GFP lentivirus; cells were transduced with Slc7a1 two days prior to ecotropic transduction. (D) Titer of VSV-G pseudotyped and ecotropic lentivirus, measured on Slc-hRMS. Figure 3. Optimizing chondroitin sulfate/polybrene (CS/PB) concentrations in human dermal fibroblasts. (A) Viability of HDFs measured by MTT assay after transduction in the presence of PB only or with varied concentrations of CS/PB. (B) Enhancement of transduction efficiency in HDFs by different concentrations of CS/PB, measured by FACS. (C) Quantification of transduction enhancement, showing that maximum transduction occurs at 100 μg/ml CS/PB. Figure 4. Effect of 400 μg/ml CS/PB on transduction of Slc-hRMS with ecotropic lentivirus. (A) Titer enhancement, and (B) fold change in transduction rate compared to 6 μg/ml polybrene alone. Figure 5. Lack of ecotropic transduction of HDFs in the absence of murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) FACS plot of BJ human fibroblasts, untransduced (pink) or transduced (blue) with ecotropic GFP lentivirus in both cases in the absence of receptor Slc7a1. BJ human fibroblasts transduced with ecotropic GFP lentivirus, without (B) and with (C) pre-transduction with receptor Slc7a1 (4X).

Discussion

Recombinant GAMMARETROVIRUS écotrope à base de virus leucémie murine de Moloney (MLV) et ses récepteurs mSlc7a1 sont bien étudiés et largement disponible, ayant été utilisé pendant plus de 20 ans pour fournir des transgènes dans les cellules murines. GAMMARETROVIRUS écotrope a aussi été utilisée plus récemment pour offrir oncogènes dans les cellules humaines;. Dans le contexte de la reprogrammation cellulaire, l'utilisation de mSlc7a1 pour éviter la production de virus oncogènes humains amphotropes hébergement est bien établi ^4,5 Cependant, lentivirus fournit des avantages significatifs sur GAMMARETROVIRUS dans la transduction de populations de cellules réfractaires, y compris les ⁶ cellules primaires qui sont souvent la cible souhaitable pour la reprogrammation, parce que les lentivirus de pré-intégration complexe permet la transduction des cellules ne se divisant ^7.

Les lentivirus ont été produites avec des dizaines de pseudotypes différents, y compris les MLV, dans un effort pour modifier le tropisme du virus, la toxicité et d'autres propriétés. ⁸ lentivirus écotrope MLV pseudotypé a été utilisé pour transduire des cellules de souris, ^9, mais a rarement été utilisée sur des cellules humaines ^10. Nous proposons donc l'utilisation de MLV-pseudotypées lentivirus écotrope comme un véhicule sûr, rentable et très efficace pour livrer des oncogènes connus ou présumés, y compris les facteurs cellulaires reprogrammation, pour les cellules humaines.

Il est essentiel de noter que ce protocole n'est pas entièrement éliminer le besoin de produire et d'utiliser des lentivirus pantropique, mais plutôt ce protocole sépare l'oncogène (s) du virus de la pantropique, isolation des chercheurs de potentiel d'auto-inoculation avec des virus liés au cancer. Le mSlc7a1 protéine et son homologue humain sont hSlc7a1 exprimée de manière ubiquitaire transporteurs d'acides aminés avec aucune tumorigénicité connus ou capacité à conférer un avantage de croissance sélective sur les cellules réceptrices, ¹¹ mSlc7a1 prise de risque relativement faible pour l'incorporation dans virus amphotrope. Cette étape ajoutée peut être particulièrement utile dans les laboratoires manquent de virus dédiés ou des installations de culture tissulaire du niveau requis de biosécurité.

Dans certaines situations, il peut être possible d'éliminer complètement l'utilisation de virus pantropique en transfectant le plasmide Slc7a1 directement dans les cellules cibles, mais de nombreuses cellules qui seraient des cibles utiles de cette technique sont aussi réfractaires à la transfection. Comme alternative, la possibilité d'isoler les cellules transduites-Slc7a1 par sélection blasticidine signifie que VSV-G lentivirus pseudotypées peut être utilisée qu'une fois pour générer un stock de cellules exprimant le récepteur, après quoi le virus écotrope peut être utilisée en routine pour la transduction de ces cellules pour de nombreux expériences. Les chercheurs devraient toujours suivre leurs directives de sécurité institutionnel pour travailler avec toute lentivirus, quel que soit son tropisme.

Les titres de virus écotrope obtenus avec ce protocole sont modérément plus faible que le virus VSV-pseudotypées, généralement à 10-20% du titre du virus pantropique, en accord avec les études précédentes. ⁹ Ces titres ont été mesurés dans les cellules humaines transduites avec Slc7a1 stablement, de sorte que le plus faible titre observé pour le virus écotrope peut être en partie due à l'expression variée du gène du récepteur dans les cellules cibles. Néanmoins, les titres viraux obtenus dans notre protocole sont plus que suffisantes pour la plupart des applications et conduire à la transduction de la majorité des cellules, dans certains cas> 90% des cellules.

Centrifugation basé techniques sont couramment utilisées pour concentrer les particules virales. Toutefois, la centrifugation nécessite plusieurs heures, génère des aérosols infectieux, et peut entraîner une perte importante de particules virales. ¹² Comme alternative, la complexation avec CS / PB peut être utilisé pour améliorer la transduction sans altérer le tropisme viral. ³ Cette méthode est rapide (5 minutes ) et peu coûteux (0,03 $ par tranche de 10 virus ml), tandis qu'environ tripler le titre observé. Aucun équipement spécial ou de réactifs de propriété sont nécessaires, et nous avons observé un minimum de toxicité aiguë après exposition des HDFS à CS / PB, en accord avec des travaux antérieurs dans d'autres lignées cellulaires. ¹³ Un inconvénient potentiel de ce protocole est que certains complexes visibles au microscope polymères adhèrent à les cellules pendant plusieurs jours dans la culture. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que ces complexes, tout en n'étant pas manifestement toxiques pour les cellules, peuvent avoir des effets plus subtils sur les processus cellulaires.

Ici, nous avons décrit une méthodologie pour sûr et efficace de transduction des cellules humaines avec des facteurs oncogènes. Cette approche devrait être d'une grande utilité pour les chercheurs qui étudient les oncogènes et biologie des cellules souches, y compris les cellules iPS.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murine MLV receptor
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G envelope
pCMV-dR8.91	D. Trono lab14		Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic envelope
FUGW	Addgene	14883	GFP control plasmid
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Fisher	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021