在发展中国家小鼠视网膜体内电穿孔
Summary
一个执行要么增益或丧失功能的研究目的，方法纳入到小鼠的视网膜细胞的质粒DNA<em>在体内</em>提交。这种方法利用瞬态外部电场的应用诱导细胞质膜的渗透性增加。
Abstract
哺乳动物的视网膜发育过程中基因表达的功能特性仍然是一个重大的挑战。基因打靶生成功能击倒构或有条件的损失仍然是成本和劳动强度大，以及耗时。除了这些挑战，视网膜表达基因可能导致意想不到的困惑以外的视网膜中有重要作用，当使用基因敲除方法。此外，试图找出一个细胞的命运规范和/或终末分化的作用时，能够在增益功能实验的基因异位表达可以是极其宝贵的。
我们提出了DNA质粒的快速和有效地纳入到由新生小鼠视网膜电的方法。短的电脉冲，上述某一个领域在质膜透性的瞬态增加强度 ，促进跨1,2,3,4膜材料转让，应用程序。开创性的工作表明，可以利用哺乳动物细胞的基因转移的方法诱导形成了亲水性的细胞膜，使高电荷的DNA通过脂质双分子层通过5毛孔电。不断的技术发展导致的电作为在体内的基因转移方法，在多个鼠标组织，包括视网膜，这是本文所述6，7，8，9，10的方法的可行性。
DNA溶液注入视网膜下腔，使DNA之间的视网膜色素上皮细胞和视网膜的新生（P0），鼠标和电脉冲，适用于使用镊子电极。鼠标眼睛外侧的位置可以容易镊子电极必要的负面极DNA视网膜正极对齐方向。可确定产后第2天（P2），广泛采纳和转移的基因的表达。由于缺乏显着的视网膜细胞的横向迁移，电穿孔和非电穿孔地区产生。内部组织学控制在适当情况下可作为非电穿孔地区。
视网膜电可以用来表示下一个无处不在的启动子的基因，如冠状动脉造影，或扰乱使用shRNA结构或Cre重组酶基因的功能。更有针对性的表达，可以实现设计与细胞特异性基因的启动子的结构。电穿孔细胞的可视化是通过使用双顺反子结构表达GFP或电穿孔共同构建一个绿色荧光蛋白的表达。此外，多重结构的组合基因的影响或不同基因的功能，同时增益和损失研究可能会被电。视网膜电也可能被用于分析基因顺式调控元件，通过产生适当的表达结构和缺失突变体。可以用这样的实验，找出不足或细胞特异性基因表达11规定的独联体监管区域。潜在的实验是有限的，只有通过构建可用性。
Protocol
Discussion
在体内电穿孔代表了视网膜细胞DNA的表达质粒转化的快速和有效的方法。此方法允许实验者执行增益功能研究异位引入一个广泛表达的启动子的控制下一个感兴趣的基因或执行使用shRNA结构针对感兴趣的基因功能研究的损失。此外，多个DNA质粒可同时电穿孔，使实验者分析多个基因的影响，或打掉一个基因，同时引入利益的第二个基因。驾驶表达Cre重组质粒电穿孔也可以利用，以消除在时?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院R01EY020560 – 01和一个WM凯克青年医学研究奖的学者。作者想感谢他的帮助，在视网膜制剂和注射的成像约瑟夫Bedont。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | J.T. Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek USA | 4583 | N/A |
Referências
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