In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina
Summary
Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie studies<em> In vivo</em> Wordt gepresenteerd. Deze methode speelt in op de tijdelijke verhoging van de permeabiliteit van de cel-plasma membranen veroorzaakt door de toepassing van een extern elektrisch veld.
Abstract
De functionele karakterisering van genen die tot expressie tijdens de zoogdieren het netvlies ontwikkeling blijft een belangrijke uitdaging. Gene targeting op constitutieve of voorwaardelijke verlies van functie knockouts genereren blijft kosten en arbeidsintensief, maar ook tijdrovend. Toe te voegen aan deze uitdagingen, retina uitgedrukte genen kan een essentiële rol buiten het netvlies leidt tot onbedoelde verwart hebben bij het gebruik van een knock-out aanpak. Verder kan de mogelijkheid om ectopisch drukken een gen in een winst van functie experiment uiterst waardevol bij een poging om een rol in het lot van de cel specificatie en / of terminale differentiatie te identificeren.
We presenteren een methode voor een snelle en efficiënte integratie van DNA plasmiden in de neonatale muis netvlies door middel van elektroporatie. De toepassing van korte elektrische impulsen boven een bepaalde veldsterkte resulteert in een voorbijgaande stijging in het plasma membraan permeabiliteit, het vergemakkelijken van de overdracht van het materiaal over het membraan 1,2,3,4. Baanbrekende werk aangetoond dat elektroporatie kunnen worden gebruikt als een methode van de genetische overdracht in cellen van zoogdieren door het induceren van de vorming van hydrofiele plasmamembraan poriën waardoor de doorgang van sterk geladen DNA door middel van de lipide bilaag 5. Voortdurende technische ontwikkeling heeft geresulteerd in de levensvatbaarheid van elektroporatie als een methode voor in vivo genoverdracht in meerdere muis weefsels waaronder het netvlies, de methode die is hierin 6, 7, 8, 9, 10 beschreven.
DNA-oplossing wordt geïnjecteerd in de subretinale ruimte, zodat DNA wordt geplaatst tussen de retinale pigment epitheel en het netvlies van de neonatale (P0) muis en elektrische pulsen worden toegepast met behulp van een pincet elektrode. De zijdelingse plaatsing van de ogen in de muis zorgt voor de gemakkelijke oriëntatie van de pincet elektrode om de nodige negatieve pool-DNA-netvlies-positieve pool uitlijning. Uitgebreide integratie en expressie van genen die overgedragen kunnen worden geïdentificeerd door postnatale dag 2 (P2). Vanwege het ontbreken van significante zijwaartse migratie van cellen in het netvlies, zijn geëlektroporeerd en niet-geëlektroporeerd regio's gegenereerd. Niet-geëlektroporeerd regio's kunnen dienen als interne histologische controles waar nodig.
Retinale elektroporatie kan worden gebruikt om een gen onder een alomtegenwoordige promotor, zoals CAG uit te drukken, of om gen-functie met behulp van shRNA construeert of Cre-recombinase verstoren. Meer gerichte expressie kan worden bereikt door het ontwerpen van constructies met cel specifiek gen promoters. Visualisatie van geëlektroporeerde cellen is bereikt met behulp van bicistronische bouwt uiten van GFP of door de co-electroporating een GFP-expressie-construct. Bovendien kunnen meerdere constructies worden geëlektroporeerde voor de studie van de combinatorische gen effecten of gelijktijdige winst en verlies van functie van verschillende genen. Netvlies elektroporatie kan ook worden gebruikt voor de analyse van genomische cis-regulatorische elementen door het genereren van juiste expressie constructen en deletiemutanten. Dergelijke experimenten kunnen worden gebruikt om de cis-regulerende gebieden voldoende of vereist zijn voor cel-specifieke genexpressie 11 te identificeren. Mogelijke experimenten zijn alleen beperkt door de bouw beschikbaarheid.
Protocol
Discussion
In vivo elektroporatie staat voor een snelle en efficiënte methode voor de transformatie van retinale cellen met DNA expressie plasmiden. Deze methode laat de experimentator te winnen van de functie studies uitvoeren door ectopisch de introductie van een gen van interesse onder de controle van een alom uitgesproken organisator of verlies van functie studies uit te voeren door gebruik te maken shRNA constructies gericht op genen van belang. Bovendien kunnen meerdere DNA plasmiden gelijktijdig worden geëlektrop…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIH R01EY020560-01 en door een WM Keck Young Scholar in Medical Research Award. De auteurs willen graag Joseph Bedont bedanken voor zijn hulp tijdens de beeldvorming van het netvlies voorbereidingen en injecties.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | J.T. Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek USA | 4583 | N/A |
Referências
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
