開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで
Summary
ゲインまたは機能研究の損失のいずれかを実行する目的のためのマウス網膜細胞へのプラスミドDNAの取り込みのための方法<em> in vivoで</em>提示されます。このメソッドは、外部電場の印加によって誘導される細胞の細胞膜の透過性の一過性増加を利用しています。
Abstract
哺乳類の網膜の開発の過程で発現する遺伝子の機能解析は重要な課題である。関数のノックアウトの構成的または条件付き損失を生成するためにジーンターゲッティングは、コストや手間が、同様に時間のかかる作業のまま。これらの課題に加えて、網膜はノックアウトのアプローチを使用するときに遺伝子が意図しない困惑さにつながる網膜の外側に不可欠な役割を持っていることが表明した。細胞の運命の仕様および/または分化における役割を同定しようとすると、さらに、異所的機能の実験の利得の遺伝子を発現する能力は非常に価値があります。
我々は、エレクトロポレーションにより新生児マウスの網膜へのDNAプラスミドの迅速かつ効率的な組み込みのための方法を提示する。膜1,2,3,4にわたって材料の移転を促進する細胞膜透過性の一過性増加に一定の電界強度の結果、上記の短い電気インパルスのアプリケーション。画期的な作品は、エレクトロポレーションは、脂質二重膜5を介して高度に荷電したDNAの通過を可能にする親水性の原形質膜の細孔の形成を誘導することにより、哺乳動物細胞への遺伝子導入の方法として利用され得ることを実証した。継続的な技術開発は、網膜、ここ6、7、8、9、10に記載されているメソッドを含む複数のマウス組織におけるin vivoでの遺伝子導入のための方法として、エレクトロポレーションの実行可能性をもたらした。
そのDNAが新生児（P0）のマウス及び電気パルスの網膜色素上皮と網膜の間に配置されるようにDNA溶液をピンセット電極を使用して適用される網膜下腔に注入される。マウスの眼の横方向の配置が必要な負極- DNA -網膜-正極配置にピンセット電極を容易に方向することができます。挿入遺伝子の大規模な組み込みと発現は生後2日目（P2）によって識別できます。網膜の細胞の重要な側方移動の不足のため、エレクトロポレーションおよび非エレクトロポレーション領域が生成されます。非エレクトロ地域はどこに適切な内部組織学的コントロールとして機能することができる。
網膜エレクトロポレーションは、CAGのように、ユビキタスプロモーター下に遺伝子を発現する、またはshRNAコンストラクトまたはクレアンリコンビナーゼを用いて遺伝子機能を破壊するために使用することができます。よりターゲットを絞った発現は細胞特異的遺伝子のプロモーターと構造を設計することにより達成することができます。エレクトロポレーションした細胞の可視化は、GFPを発現したり、GFPの発現構築物の共同electroporatingでバイシストロン構文を使用して実現されます。さらに、複数の構成要素は、コンビナトリアル遺伝子の効果や異なる遺伝子の機能の同時利得と損失の研究のためにエレクトロポレートされることがあります。網膜エレクトロポレーションは、適切な発現コンストラクトおよび欠失変異体を生成することで、ゲノムのシス調節エレメントの解析に利用することができる。このような実験は、細胞特異的遺伝子発現11の十分なまたは必要なシス調節領域を同定するために使用することができます。潜在的な実験は、構造可用性によって制限されます。
Protocol
Discussion
in vivoでエレクトロポレーションは、DNAの発現プラスミドと網膜細胞の形質転換のための迅速かつ効率的な方法を表します。このメソッドは、実験者が異所的に普遍的に発現プロモーターの制御下に目的の遺伝子を導入することにより、機能研究のゲインを実行したり、関心のある遺伝子を標的とするshRNAコンストラクトを使用して、関数の研究の損失を実行することができます。さら…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH R01EY020560 – 01でと医学研究賞のWMケックヤングの学者によって賄われていた。著者らは、網膜の調製と注射の撮影中に彼の援助のためにジョセフBedontに感謝します。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | J.T. Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek USA | 4583 | N/A |
Referências
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