In vivo elektroporering av utvecklingsländer Mouse Retina
Summary
En metod för införlivandet av plasmid DNA i murina näthinnans celler för att utföra antingen vinst-eller förlust av funktion studier<em> In vivo</em> Presenteras. Metoden drar nytta av övergående ökning av permeabiliteten i cellmembran plasma orsakas av tillämpning av ett yttre elektriskt fält.
Abstract
Den funktionella karakterisering av gener som uttrycktes under däggdjur näthinnans utveckling är fortfarande en stor utmaning. Riktad genmodifiering för att generera konstitutiv eller villkorlig förlust av funktion knockouts förblir kostnader och arbetskrävande, såväl som tidskrävande. Lägga till dessa utmaningar, uttryckt näthinnan gener kan ha viktiga roller utanför näthinnan vilket leder till oavsiktliga blandar ihop när man använder en knockout strategi. Dessutom kan förmågan att ectopically uttrycka en gen i en vinst på funktion försök att vara mycket värdefull när man försöker hitta en roll i cell öde specifikation och / eller terminal differentiering.
Vi presenterar en metod för snabb och effektiv integrering av DNA plasmider i neonatal musen näthinnan av elektroporation. Tillämpningen av korta elektriska impulser över ett visst resultat fältstyrkan på en övergående ökning av plasma-permeabilitet, underlätta överföring av material över membranet 1,2,3,4. Banbrytande arbete visat att elektroporation skulle kunna användas som en metod för genöverföring till däggdjursceller genom att inducera bildning av hydrofila porer plasmamembran möjliggöra passagen av laddad DNA genom membranet 5. Kontinuerlig teknisk utveckling har resulterat i livskraften i elektroporation som metod för in vivo genöverföring i flera mus vävnader, inklusive näthinnan, den metod som beskrivs häri 6, 7, 8, 9, 10.
DNA-lösning sprutas in i subretinal utrymme så att DNA är placerad mellan näthinnans pigmenterade epitel och näthinnan i neonatal (P0) mus och elektriska pulser tillämpas med hjälp av en pincett elektrod. Den laterala placering av ögonen i musen gör det möjligt att lätt orientering pincett elektroden till de nödvändiga negativa polen-DNA-näthinnan-positiva polen justering. Omfattande integrering och uttryck av överförda gener kan identifieras genom postnatal dag 2 (P2). På grund av avsaknaden av märkbara rörelser i sidled migration av celler i näthinnan, är electroporated och icke-electroporated regioner genereras. Icke-electroporated regioner kan fungera som interna histologisk kontroll där så är lämpligt.
Retinal elektroporation kan användas för att uttrycka en gen i en allestädes närvarande promotor, som CAG, eller att inaktivera genen med hjälp av shRNA konstruktioner eller Cre-recombinase. Mer riktade uttryck kan uppnås genom att utforma konstruktioner med cell-specifik gen initiativtagare. Visualisering av electroporated celler sker med hjälp av bicistronic konstruktioner som uttrycker GFP eller genom samarbete electroporating en GFP uttryck konstruktion. Dessutom kan flera konstruktioner vara electroporated för att studera kombinatorisk gen effekter eller samtidig vinst och förlust av funktion av olika gener. Näthinnan elektroporation kan även användas för analys av genomiska cis-reglerande element genom att skapa lämpliga uttryck konstruerar och mutanter radering. Sådana experiment kan användas för att identifiera cis-reglerande regioner tillräcklig eller krävs för cellspecifik genuttryck 11. Potentiella experiment begränsas bara av konstruera tillgänglighet.
Protocol
Discussion
In vivo elektroporering representerar en snabb och effektiv metod för omvandling av näthinnans celler med plasmider DNA uttryck. Denna metod gör försöksledaren att utföra vinst funktion studier av ectopically att införa en gen av intresse under kontroll av en ubiquitously uttryckt promotor eller utföra förlust av funktion studier med hjälp av shRNA konstruktioner riktad genmodifiering av intresse. Dessutom kan flera DNA plasmider vara electroporated samtidigt, så att försöksledaren att analysera fl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av NIH R01EY020560-01 och en WM Keck unge lärde i medicinsk forskning Award. Författarna vill tacka Josef Bedont för hans hjälp under avbildning av näthinnans preparat och injektioner.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | J.T. Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek USA | 4583 | N/A |
Referências
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
