ReAsH / Flash Labeling und Bildanalyse von Tetracysteinmotiv Sensor Proteinen in Zellen
Summary
Die biarsenical Farbstoffe Flash und ReAsH binden spezifisch an Tetracysteinmotiv Motive in Proteinen und kann wahlweise Label Proteine in lebenden Zellen. Kürzlich diese Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Sensoren für verschiedene Proteinkonformationen oder oligomeren Zustände zu entwickeln. Wir beschreiben die Label-Ansatz und Methoden zur quantitativen Analyse bindend.
Abstract
Fluoreszierende Proteine und Farbstoffe sind wesentliche Instrumente für die Untersuchung von Protein Menschenhandel, Lokalisation und Funktion in Zellen. Während fluoreszierende Proteine, wie zB grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden intensiv als Fusionspartner an Proteine verwendet werden, um die Eigenschaften eines Proteins von Interesse 1, die jüngsten Entwicklungen bei kleineren Tags ermöglichen neue Funktionalitäten von Proteinen in Zellen wie Konformationsänderung untersucht werden track und Protein-Vereins 2, 3. Ein kleiner Tag-System beinhaltet eine Tetracysteinmotiv Motiv (CCXXCC) genetisch in ein Zielprotein, das biarsenical Farbstoffe bindet eingefügt, ReAsH (rote Fluoreszenz) und Flash (grün fluoreszierend), mit hoher Spezifität auch in lebenden Zellen 2. Die TC / biarsenical Farbstoff-System bietet weit weniger sterische Einschränkungen an den Host-Protein als fluoreszierende Proteine, die mehrere neue Ansätze ermöglicht hat, Konformationsänderung und Protein-Protein-Interaktionen 4-7 messen. Wir haben vor kurzem eine neuartige Anwendung des TC tags als Sensoren der Oligomerisierung in Zellen, die mutierte Huntingtin, die, wenn mutierte Aggregate in Neuronen in Huntington-Krankheit 7. Huntingtin wurde mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen, einer ein fluoreszierendes Protein zu Protein Ort zu verfolgen und die zweite ein TC-Tag, das bindet nur biarsenical Farbstoffe in Monomeren getaggt. Daher aktiviert Veränderungen in Kolokalisation zwischen Protein und biarsenical Farbstoff Reaktivität submikroskopischen Oligomergehalt räumlich innerhalb von Zellen abgebildet werden. Hier beschreiben wir, wie TC-markierte Proteine fusioniert an ein fluoreszierendes Protein (Cherry, GFP oder GFP) mit Flash oder ReAsH in Live Säugetierzellen und wie die beiden Farben-Fluoreszenz (Cherry / Flash, CFP / Flash oder GFP / quantifizieren Label ReAsH Kombinationen).
Protocol
Discussion
Der Ansatz zur Kennzeichnung Proteinlokalisierung mit einem fluoreszierenden Protein und konformativen Eigenschaften mit einem zweiten Farbstoff bietet viel Potenzial für die Zuordnung, wo verschiedene Konformationen von Proteinen in Zellen und Ereignisse, die die Dynamik der Protein-Konformation ändern anfallen. ReAsH / Flash wurde zuerst als in-cell-Sensor für die Proteinfaltung von Säugetieren zelluläre Retinsäure-bindende Protein I 4 verwendet. In diesem Beispiel, das Flash gebunden an ein TC-Tag in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien an DMH und TDM (NHMRC Projekt Zuschüsse) finanziert. DMH ist ein Grimwade Fellow, durch die Miegunyah Trust finanziert.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Referências
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