ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine
Summary
צבעים biarsenical פלאש ReAsH להיקשר באופן ספציפי מוטיבים tetracysteine בחלבונים והוא יכול סלקטיבי תווית חלבונים בתאים חיים. לאחרונה באסטרטגיה זו תיוג נעשה שימוש כדי לפתח חיישנים עבור תצורות חלבונים שונים או מדינות oligomeric. אנו מתארים את גישת התיוג ושיטות כמותית לנתח מחייב.
Abstract
חלבונים פלורסנט וצבעים הם כלים חיוניים לחקר לוקליזציה סחר, חלבונים לתפקד בתאים. בעוד חלבוני ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) נעשה שימוש נרחב כשותפים היתוך חלבונים כדי לעקוב אחר תכונות של חלבון של עניין 1, ההתפתחויות האחרונות עם תגיות קטנות מאפשרות פונקציות חדשות של חלבונים להיבחן בתאים כגון שינוי קונפורמציה וחלבון אסוציאציה 2, 3. אחת מערכת תג קטן כרוך מוטיב tetracysteine (CCXXCC) מוכנס לתוך גנטית חלבון מטרה, אשר נקשר צבעים biarsenical, ReAsH (אדום ניאון) ו-Flash (ירוק זרחני), עם סגוליות גבוהה אפילו בתאים חיים 2. מערכת TC / biarsenical לצבוע מציעה אילוצים סטרית הרבה פחות חלבון מאשר לארח חלבוני ניאון אשר אפשרה מספר גישות חדשות כדי למדוד שינוי קונפורמציה ו חלבונים אינטראקציות 4-7. אנחנו לאחרונה פיתחה יישום הרומן של תגיות TC כמו חיישנים של oligomerization בתאים לבטא huntingtin מוטנטים, אשר כאשר מוטציה אגרגטים נוירונים מחלת הנטינגטון 7. Huntingtin היה מתויג עם שני צבעי ניאון, אחד חלבון פלואורסצנטי לעקוב אחר המיקום חלבון, ואת תג שנייה TC שרק נקשר צבעים biarsenical ב מונומרים. לפיכך, שינויים colocalization בין חלבון תגובתיות לצבוע biarsenical מופעלת תוכן oligomer submicroscopic להיות ממופה מרחבית בתוך התאים. כאן אנו מתארים כיצד תווית TC-tagged חלבונים התמזגו חלבון פלואורסצנטי (שרי, GFP או CFP) עם פלאש או ReAsH בתאי יונקים לחיות וכיצד לכמת את הקרינה two צבע (שרי / Flash, CFP / Flash או ה-GFP / ReAsH שילובים).
Protocol
Discussion
הגישה לוקליזציה חלבון תווית עם חלבון פלואורסצנטי ומאפיינים קונפורמציה עם צבע שנייה מציע הרבה פוטנציאל למיפוי בו תצורות שונות של חלבונים בתאים לצבור ואירועים לשנות את הדינמיקה של קונפורמציה בחלבון. ReAsH / פלאש שימש לראשונה כחיישן ב-cell עבור קיפול חלבונים של חלבון יונק?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענקים DMH ו TDM (NHMRC מענקים הפרוייקט). DMH הוא עמית Grimwade, שמומן על ידי הקרן Miegunyah.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
