ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析
Summary
biarsenical染料FlashとReAsHは、タンパク質のテトラモチーフに特異的に結合し、選択的に生細胞内のタンパク質にラベルを付けることができます。最近このラベリング戦略は、異なるタンパク質のコンフォメーションまたはオリゴマー状態のセンサーを開発するために使用されています。我々は、定量的に結合分析するためにラベルをつける方法とメソッドを説明します。
Abstract
蛍光タンパク質と色素が細胞内のタンパク質輸送、局在化と機能の研究に欠かせないツールです。このような緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質は広く関心1のタンパク質の特性を追跡するために蛋白質に融合パートナーとして使用されているが、小さなタグと最近の進展は、このようなコンフォメーションの変化などの細胞で検査されるタンパク質の新しい機能を有効にすると蛋白質-関連2、3。一つの小さなタグでも、システムは生細胞に高い特異性と2を遺伝的にbiarsenical染料に結合する標的蛋白質、挿入テトラのモチーフ（CCXXCC）、ReAsH（赤色蛍光）とFLASH（緑色蛍光）を伴います。 TC / biarsenical染料のシステムは、コンフォメーション変化とタンパク質間相互作用4-7測定するためにいくつかの新しいアプローチを有効にしている蛍光タンパク質よりもホストのタンパク質へのはるかに少ない立体制約を提供しています。我々は最近、ハンチントン病7の神経細胞に凝集体を変異変異ハンチンチンを発現する細胞のオリゴマー化のセンサーとして、TCタグの新規な用途を開発した。ハンチンチンは、2つの蛍光色素、一つのタンパク質の場所を追跡するために蛍光タンパク質、及びだけモノマーのbiarsenical色素を結合する第二TCタグでタグ付けされた。したがって、タンパク質とbiarsenical染料の反応性との間の共局在の変化は、空間的に細胞内にマッピングする顕微鏡的オリゴマーのコンテンツを有効にする。ここでは、FlashやReAsH生哺乳動物細胞での方法、および2つの色の蛍光（チェリー/フラッシュ、CFP / / FlashやGFPを定量化すると蛍光タンパク質（チェリー、GFPまたはCFP）に融合されたTC -タグタンパク質を標識する方法について説明します。 ReAsHの組み合わせ）。
Protocol
Discussion
第二の色素と蛍光タンパク質とコンホメーション特性を持つラベルのタンパク質局在化へのアプローチは、タンパク質の異なるコンフォメーションは、細胞やタンパク質の立体構造のダイナミクスを変更するイベントに積算どこにマッピングするための多くの潜在的な提供しています。 ReAsH /フラッシュは、最初の哺乳類細胞内レチノイン酸結合タンパク質I 4のタンパク質の折り畳み…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DMHとTDM（NHMRCプロジェクトの助成金）への補助金によって賄われていた。 DMHはMiegunyahトラストが資金提供グリムフェロー、です。
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
