ReAsH / Flash Маркировка и анализ изображений белков Tetracysteine датчика в клетках
Summary
Biarsenical красителей вспышкой и ReAsH специфично связываются с tetracysteine мотивов в белках и может выборочно этикетке белков в живых клетках. В последнее время эта маркировка стратегия была использована для разработки датчиков для различных конформаций белков или олигомерных государств. Мы описываем маркировки подход и методы количественного анализа связывания.
Abstract
Флуоресцентные белки и красителей являются необходимыми инструментами для исследования белков торговли людьми, локализации и функции в клетках. Хотя флуоресцентные белки, такие как зеленая флуоресценция белка (GFP), широко использовались в качестве партнеров для слияния белков отслеживать свойства белка интересов 1, последние события с меньшей теги позволяют новых функциональных белков должны быть рассмотрены в клетках, таких как изменение конформации и белково-ассоциации 2, 3. Одна маленькая система включает в себя теги tetracysteine мотив (CCXXCC) генетически вставляется в целевой белок, который связывается с biarsenical красители, ReAsH (красный флуоресцентный) и Flash (зеленый флуоресцентный), с высокой специфичностью даже в живые клетки 2. TC / biarsenical красителя система предлагает гораздо меньше стерических ограничений на хост белка, чем флуоресцентные белки, что позволило несколько новых подходов для оценки конформационных изменений и белок-белковых взаимодействий 4-7. Недавно мы разработали новое применение ТК теги как датчики олигомеризации в клетках, экспрессирующих мутантный Huntingtin, который при мутировал агрегатов в нейронах в Хантингтон болезни 7. Huntingtin была помечена с двумя флуоресцентными красителями, один флуоресцентный белок отслеживать местоположение белка, а второй теги TC которые только связывает biarsenical красителей в мономеров. Следовательно, изменения в колокализации между белком и biarsenical красителя реактивность включен субмикроскопических содержание олигомеров быть пространственно отображается внутри клеток. Здесь мы опишем, как этикетка TC-меткой белков, слитый с флуоресцентный белок (вишня, GFP или CFP) со вспышкой или ReAsH в живых клетках млекопитающих и как количественно два цвета флуоресценции (вишня / Flash, CFP / Flash или GFP / ReAsH комбинации).
Protocol
Discussion
Подход к этикетке локализации белка с флуоресцентным белком и конформационные свойства со вторым красителем предлагает большой потенциал для отображения, где разные конформации белков накапливаются в клетках и события, которые изменяют динамику конформации белка. ReAsH / Flash был впервы…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет грантов для ДМГ и TDM (NHMRC проекту гранты). ДМГ является Гримвад сотрудник, финансируемый Miegunyah Trust.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
