Nós fornecemos um protocolo melhorado para a extração de DNA de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Células microbianas são separados da matriz mat antes da extração e purificação DNA. Isso aumenta a concentração, qualidade e tamanho do DNA. O protocolo pode ser usado para outras amostras refratário.
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Artigo de método
Extração de DNA de alto peso molecular de Esteiras Microbianas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Análise bem sucedida e precisas e interpretação de dados metagenomic é dependente da extração eficiente de alta qualidade, de alto peso molecular DNA comunidade (HMW). No entanto, as amostras de mat ambientais muitas vezes apresentam dificuldades para a obtenção de grandes concentrações de DNA de alta qualidade HMW,. Tapetes microbianos hipersalinos contêm grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) 1 e sais que podem inibir a aplicações a jusante do DNA extraído. Métodos diretos e duras são muitas vezes utilizados na extração de DNA a partir de amostras refratário. Estes métodos são normalmente utilizados, pois o EPS em esteiras, uma matriz adesiva, liga-se 2,3 DNA durante a lise direta. Como resultado de métodos mais duros de extração, o DNA torna-se fragmentado em tamanhos pequenos 4,5,6.
O DNA, assim, torna-se inadequado para os grandes inserir clonagem do vetor. A fim de contornar essas limitações, apresentamos uma metodologia melhorada para extrair DNA HMW de boa qualidade e quantidade de tapetes microbianos hipersalinos. Nós empregamos um método indireto envolvendo a separação de células microbianas a partir da matriz mat fundo através de mistura e centrifugação diferencial. A combinação de procedimentos mecânicos e químicos foi usado para extrair e purificar o DNA das células microbianas extraído. Nosso protocolo produz cerca de 2 mg de HMW DNA (35-50 kb) por grama de amostra de esteira, com um A 260 / 280 relação de 1,6. Além disso, a amplificação do 16S rRNA genes 7 sugere que o protocolo é capaz de minimizar ou eliminar os efeitos inibitórios de contaminantes. Nossos resultados fornecem uma metodologia apropriada para a extração de DNA a partir de HMW tapetes microbianos para estudos funcionais metagenomic e pode ser aplicável a outras amostras ambientais a partir do qual a extração de DNA é um desafio.
Protocolo
1. Extração de células microbianas:
- Homogeneizar tapetes microbianos com um pilão de moer estéril, misturando bem. Coloque todos os cerca de 30 g (peso úmido) de material mat homogeneizadas em recipiente estéril de liquidificador Waring, adicionar cerca de 100 mL de NaCl 1 M (ou uma concentração específica para amostra em uso), e mistura três vezes em velocidade média por 1 min com resfriamento intermitente em um freezer -20 ° C por 1 min. Transfira a pasta em um frasco de centrífuga de 250 mL e completar o volume vazio restante com 1 M NaCl. Prepare a solução de NaCl em água autoclavada DI e filtro de esterilizá-lo.
- Além disso desalojar as célul....
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Discussão
Dado que a remoção total de células a partir de amostras mat complexa e altamente diversificada microbiana não é prático, a principal preocupação é o quão bem as células extraídas representar a comunidade microbiana total mat. Em um estudo anterior, PCR-DGGE análise dos genes 16S rRNA microbiana mostrou que as cinco etapas de remoção de células utilizadas neste protocolo de extratos de células que são representativas da comunidade em geral tapete microbiano 7. O número real de extração de células passos neces.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Programa Ambiental Genomics (Grant No. EF-0723707).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| β-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polietileno glicol 8000 | Promega | V3011 | 20% em 1,2 M NaCl |
| Acetato de potássio | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT Assay dsDNA kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentro | MRNA092 | |
| Cloreto de sódio | BDH Chemicals | BDH8014 | Conc apropriado. |
| Dodecilsulfato de sódio | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% em água |
| hexametafosfato de sódio | Merck Química | SX0583-3 | 2% da água |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA Sistema | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 espectrofotômetro | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Agente de crosslinking ultravioleta | UVP | ||
| Waring Blender | Waring laboratório | LB10S |
Referências
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steff....
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Reimpressões e permissões
