La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.
Matriz de rigidez influye fuertemente en el crecimiento, diferenciación y función de las células adherentes 1-3. En la escala macro de la rigidez de los tejidos y órganos dentro del cuerpo humano abarcan varios órdenes de magnitud 4. Se sabe mucho menos acerca de cómo la rigidez varía espacialmente dentro de los tejidos, y lo que el alcance y la escala espacial de los cambios de rigidez en los procesos de enfermedades que resultan en la remodelación tisular. Para entender mejor cómo los cambios en la matriz de rigidez contribuir a la fisiología celular en la salud y la enfermedad, las mediciones de la rigidez del tejido obtenido en una escala espacial relevante para las células residentes son necesarios. Esto es particularmente cierto para el pulmón, un tejido altamente compatible y elástico en el que la remodelación de la matriz es una característica importante en enfermedades como el asma, el enfisema, la hipertensión y la fibrosis. Para caracterizar el medio ambiente local mecánica del parénquima pulmonar en una escala espacial relevante para las células residentes, que han desarrollado métodos para medir directamente las propiedades locales elástica de tejido fresco de pulmón murino mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) microindentation. Con la elección apropiada de AFM penetrador, en voladizo, y profundidad de penetración, estos métodos permiten realizar mediciones de locales módulo de tejido de corte en paralelo con contraste de fase y de imágenes de fluorescencia de la región de interés. El muestreo sistemático de las tiras de tejido proporciona mapas de las propiedades mecánicas del tejido que revelan las variaciones locales de espacio en el módulo de corte. Las correlaciones entre las propiedades mecánicas y características subyacentes anatomopatológicas ilustrar cómo la rigidez varía con la deposición de la matriz en la fibrosis. Estos métodos pueden extenderse a otros tejidos blandos y los procesos de la enfermedad para revelar cómo las propiedades mecánicas del tejido local varían a través del espacio y la progresión de la enfermedad.
Caracterización mecánica del tejido pulmonar con microindentation AFM ofrece una resolución espacial sin precedentes (Fig. 4), proporcionando una perspectiva única sobre las variaciones descrito en la rigidez del tejido. Como ejemplo de su utilidad, previa escala macro mediciones en bandas de tejido normal y fibrosis pulmonar indica un aproximado de 2 a 3 veces aumento de la elastancia con fibrosis 11,12. Por el contrario, revela que microindentation AFM endurecimiento del tejido es muy localizada, con algunas regiones presentan aumentos de hasta ~ 30 veces en módulo de corte por encima de la mediana observada en el tejido pulmonar normal 10. Como matriz de rigidez ahora se sabe que influyen en la crítica función de las células, estas mediciones locales ofrecen parámetros muy valiosa para mejorar la biofidelity de estudio de cultivos celulares de células de los pulmones.
Varias cuestiones de índole práctica con el uso de tiras delgadas de tejido pulmonar. Las superficies de las tiras no sea totalmente plana, como el perfil del tejido sigue la arquitectura subyacente de los alvéolos. El sistema AFM se ajusta automáticamente la posición de punta en la dirección Z durante el sangrado cuando la superficie de la muestra variación de la altura es menor que 15 micras para ayudar a superar este desafío. Las mediciones se realizan a temperatura ambiente, no 37 ° C, por lo que las desviaciones en las propiedades mecánicas causadas por esta variación en la temperatura no puede ser evaluada, aunque se espera que sea menor. La influencia de la arquitectura de la pared alveolar subyacente en observar las propiedades mecánicas es difícil de determinar con la configuración del microscopio de luz actual. Por ejemplo, sería conveniente determinar si las paredes alveolares presentan anisotropía y propiedades mecánicas diferentes al sangrado en direcciones alineadas con o transversal al plano de la pared. Sin embargo, los ejemplares actuales son gruesas y el sistema de imagen no tiene capacidades 3D, por lo que no es posible determinar la orientación local de la pared alveolar en cada punto de contacto. Por último, la influencia de los componentes celulares de medir las propiedades mecánicas aún no ha sido dilucidado. En los métodos detallados aquí, no se hacen esfuerzos para eliminar específicamente los componentes celulares de los tejidos. Sin embargo, las células presentes en la superficie disponible para el sangrado es poco probable que sea viable, dado el tiempo transcurrido desde la cosecha de tejidos y la necesidad de cortar el tejido para obtener acceso a los alvéolos. Experimentos específicos para eliminar las células, o repoblar matrices con células viables, y evaluar los cambios resultantes en la rigidez del tejido que parece estar justificada.
Dado que el tejido no fijado fresco que se necesita para estas mediciones, el tiempo transcurrido desde la recolección de tejido para la medición debe ser mínimo y las muestras deben ser almacenadas a 4 ° C para evitar cambios en las propiedades mecánicas. Se debe prestar especial atención cada vez que tiras de tejido se transfieren entre los contenedores durante el lavado o la tinción de modo que un mínimo de distorsión o daño se genera. Para la aplicación de AFM en líquido, es un paso crucial para cortar el tejido lo más plano posible e inmovilizar la muestra en el portaobjetos de apoyo. Si está disponible, una máquina automática de seccionamiento como una máquina de cortar el tejido vibratome o puede ser utilizado para cortar rebanadas de espesor muy uniforme. Es importante colocar las tiras de tejido inmediatamente antes de las mediciones de AFM y minimizar el tiempo transcurrido para las mediciones de AFM en la muestra final se separará de los cubreobjetos. Una observación útil es que las grandes bandas parecen conectar de manera más estable para cubrir los resbalones y permanecer en su lugar durante un período prolongado en que las pequeñas tiras de PBS.
Microindentation AFM puede caracterizar muestras que abarcan una amplia gama de 100 Pa a 50 kPa (módulo de corte) cuando se utiliza un estándar de 0,06 N / m en voladizo con un diámetro de la punta esférica 5 micras. Este rango puede ser ampliado mediante sondas con diferentes constantes de los resortes, las sondas de AFM con las puntas de vidrio esférico de 0,6 a 12 um de diámetro y constantes de la primavera que van desde 0,01 hasta 0,58 N / m están disponibles comercialmente (por ejemplo, Novascan) y de uso general 3. Con una punta de 5 micras esférico, el área de contacto entre la punta teórica y el tejido es de unos 9.5 m 2 para el sangrado 400-700 nm (Fig. 1A). Consejos más o menos grandes se pueden utilizar para proporcionar las escalas más pequeñas o más grandes de la resolución espacial. Puntas piramidales también se han utilizado en microindentation AFM 13-16, proporcionando pequeñas áreas de contacto y así aumentar la resolución espacial en la cartografía, a pesar de conexión de datos es más complejo de esta geometría de la punta.
Varias limitaciones a este método se debe tener en cuenta. El pulmón ha sido tradicionalmente caracterizada mecánica no invasiva, por ejemplo el uso de presión-volumen de análisis de 17 o punch-sangría de todo el pulmón 19,20. Métodos invasivos, tales como el descrito aquí alterar la arquitectura del pulmón de manera importante a través de la pérdida de la int aire-líquidoerface que existe normalmente en los pulmones llenos de aire y la pérdida de pre-tensión que mantiene la inflación pulmonar parcial a la relajación de los músculos respiratorios. Estas limitaciones son comunes a todas las mediciones realizadas en las tiras de tejido pulmonar de 18 años. Cabe destacar, sin embargo, la rigidez media medida en el parénquima del tejido pulmonar normal (módulo de corte ~ 0.5kPa) no difieren sustancialmente de las estimaciones basadas en perforación, sangrado de los pulmones intactos en los volúmenes de descanso 19,20. Mientras que el tejido pulmonar se sabe que presentan no lineal de refuerzo con deformación creciente, no es posible probar de forma rigurosa si esta propiedad persiste hasta la escala micro, con los métodos empleados aquí. El modelo de Hertz supone homogeneidad de la muestra. Sin embargo, la mayoría de los materiales biológicos, como el parénquima pulmonar, son cada vez más heterogéneo a la disminución de escalas espaciales. La heterogeneidad de la muestra puede resultar en manchas, como la variación de módulo de Young en función de profundidad de penetración, es decir, en función de la capa o componente que está deformando. La heterogeneidad en el plano xy puede ser limitado por elegir cuidadosamente el tamaño adecuado punta esférica en función de la microestructura del material biológico propuesto por Dimitriadis EK et al. 8 Es mucho más difícil de predecir o corregir el error del modelo Hertz debido al material heterogeneidad en la dirección z. Azeloglu et al. ha propuesto recientemente un modelo híbrido computacional para caracterizar las propiedades elásticas del sustrato heterogéneo con inclusiones discretos integrados 21. Su nueva técnica proporciona un medio potencial para calcular las propiedades de la inclusión de materiales heterogéneos, la superación de las limitaciones del análisis hertzianas.
El modelo de Hertz también asume un comportamiento elástico absoluta, mientras que los materiales biológicos suelen mostrar en función del tiempo las conductas viscoelástico. Una caracterización viscoelástica lleno de tejido se puede obtener mediante la variación de las velocidades de sangrado utilizado. Es importante destacar que, previa escala macro pruebas mecánicas del tejido pulmonar normal y fibrosis demuestra débil dependencia de la frecuencia de las propiedades mecánicas del tejido pulmonar, y la preservación de las diferencias entre las propiedades de los tejidos normales y fibrótico mecánicas en todas las frecuencias a prueba 11. Estos hallazgos sugieren que la medición de las propiedades mecánicas con una velocidad de sangrado individual con AFM capta un aspecto esencial de los cambios en las propiedades mecánicas del tejido que acompañan a la fibrosis.
La relación de Poisson de 0,4 para el tejido pulmonar utilizado en este trabajo es a partir de una medición macroscópica 9. Por desgracia, la relación de Poisson a micro-escala y los cambios en estado de enfermedad no están disponibles en la literatura. Como alternativas a la E, E / (1-υ 2) o (1-υ 2) / πE (k denota la constante elástica) 22 se puede calcular a partir de microindentation AFM e informó de que la relación de Poisson es desconocida. Para la mayoría de los biomateriales de Poisson está en el rango de 0,4 a 0,5, debido a su alto contenido de agua. Dentro del rango de 0.3-0.5, el factor 1 / (1-υ 2) sólo varía desde 1,10 hasta 1,33, de manera que las variaciones razonables en la relación de Poisson ejercen sólo un efecto modesto en el módulo informó. El incremento en el módulo de corte que nos informe por tejido fibrótico en relación con el tejido normal es varias veces en magnitud, lo que implica que los errores asociados con las variaciones en el coeficiente de Poisson son menores en relación con los cambios en las propiedades mecánicas observadas.
El algoritmo actual y el código que puede ser utilizado para el análisis de los datos de fuerza-desplazamiento está sujeto a la condición de aplicación específica y las características posteriores de las diversas poblaciones de las curvas de fuerza-desplazamiento. Si un análisis más sofisticado de interés, se puede consultar el trabajo de Lin et al. 23. Los autores recopilaron una serie de estrategias sinérgicas en un algoritmo que supera muchas de las complicaciones que previamente han obstaculizado los esfuerzos para automatizar la instalación de los modelos de Hertz de los datos de sangrado.
Otras áreas están disponibles para un mayor desarrollo y explotación de este método. En los casos en que uno está interesado en la visualización de las paredes alveolares, sin etiquetado de anticuerpos, tanto la elastina y el colágeno se puede visualizar desde su señal autofluorescentes en el espectro de color verde. Por otro lado, una mejor imagen, ya sea utilizando delgadas secciones de tejidos, técnicas de imágenes en 3D, o ambos, podrían mejorar la capacidad de relacionar la arquitectura del tejido subyacente con las propiedades mecánicas. Mientras que los métodos actuales permiten a las manchas y la visualización de los componentes de la matriz extracelular, como colágeno y laminina, los esfuerzos adicionales podrían ser destinados a la tinción de marcadores de superficie celular para identificar poblaciones específicas de células y caracterizar los microambientes mecánica en las cercanías de dichas poblaciones. Alternatively, el tejido podría obtenerse de ratones que expresan fluorescencia etiquetados linaje de marcadores de células o proteínas específicas para perseguir el mismo objetivo. Finalmente, el método detallado aquí parece adecuada para caracterizar otras características anatómicas en los pulmones, como los vasos que remodelar en la hipertensión, y las vías respiratorias que remodelar en el asma. Sobre la base de su actual estado de desarrollo y el potencial de seguir mejorando, microindentation AFM parece dispuesta a ceder información valiosa sobre los cambios en la rigidez de los tejidos que acompañan a la progresión de la enfermedad en el pulmón, y sin duda será de valor en la caracterización de los cambios espaciales y temporales en el la rigidez de una variedad de otros tejidos blandos.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a A. Tager y Shea B. por su colaboración en curso, y para proporcionar el tejido pulmonar utilizada para propósitos de demostración aquí. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención HL-092961. Este trabajo fue realizado en parte en el Centro de Sistemas de Nanoescala (SNC), un miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura, que es apoyada por la National Science Foundation NSF premio en ECS-0335765. SNC es parte de la Facultad de Artes y Ciencias de la Universidad de Harvard.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |