Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em
Summary
Nous décrivons un faible coût, la méthode à haut débit pour le dépistage de l'activité endoglucanase fongiques<em> E. coli.</em> La méthode repose sur une lecture visuelle simple de la dégradation de substrat, ne nécessite pas de purification de l'enzyme, et est très extensible. Cela permet pour le dépistage rapide des grandes bibliothèques de variants enzymatiques.
Abstract
Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, et β-glucosidases) cellulose en sucres hydrolyser composante, qui à leur tour peuvent être convertis en une alcools carburants. Le potentiel d'hydrolyse enzymatique de la biomasse cellulosique pour fournir l'énergie renouvelable a intensifié ses efforts pour concevoir des cellulases pour 2 à combustible de production économique. D'intérêt particulier sont les cellulases fongiques 3-8, qui sont déjà utilisées industriellement pour les aliments et le traitement des textiles.
Identifier les variantes actives parmi une bibliothèque de cellulases mutant est critique pour le processus d'ingénierie; mutants actifs peuvent encore être testés pour des propriétés améliorées et / ou soumis à une mutagenèse supplémentaire. Ingénierie efficace des cellulases fongiques a été entravée par un manque d'outils génétiques pour les organismes indigènes et par des difficultés à exprimer les enzymes dans des hôtes hétérologues. Récemment, Morikawa et collègues a développé une méthode pour exprimer dans E. coli les domaines catalytiques des endoglucanases de H. jecorina 3,9, un champignon industriel important avec la capacité à sécréter de grandes quantités de cellulases. Fonctionnelle E. l'expression coli a aussi été rapportés pour des cellulases à partir d'autres champignons, y compris Macrophomina phaseolina 10 et Phanerochaete chrysosporium 11-12.
Nous présentons une méthode de criblage à haut débit de l'activité endoglucanase fongiques dans E. coli. (Fig 1) Cette méthode utilise la commune microbienne colorant rouge Congo (RC) pour visualiser la dégradation enzymatique de la carboxyméthylcellulose (CMC) par les cellules en croissance sur milieu solide. Le dosage de l'activité nécessite des réactifs peu coûteux, une manipulation minimale, et donne des résultats sans ambiguïté que les zones de dégradation («halos») sur le site de la colonie. Même si une mesure quantitative de l'activité enzymatique ne peut être déterminé par cette méthode, nous avons constaté que la taille de halo est corrélée avec l'activité enzymatique totale dans la cellule. Une caractérisation plus poussée des différents clones positifs déterminera, fitness relative des protéines.
Bactériens traditionnels dosages toute l'activité des cellules MCC / CR 13 impliquent versant CMC sur gélose contenant des colonies, qui est soumis à la contamination croisée, ou des cultures en incubation dans les puits d'agar CMC, qui se prête moins à grande échelle d'expérimentation. Nous rapportons ici un protocole amélioré qui modifie les méthodes de lavage existants 14 pour l'activité cellulase: cellules cultivées sur gélose CMC sont retirés avant la coloration CR. Notre protocole réduit considérablement la contamination croisée et est hautement évolutive, permettant le dépistage rapide de milliers de clones. En plus de H. enzymes jecorina, nous avons exprimé et projeté variantes endoglucanase de la aurantiacus Thermoascus et Penicillium decumbens (figure 2), ce qui suggère que ce protocole est applicable à partir d'enzymes une gamme d'organismes.
Protocol
Discussion
Le protocole décrit ici permet l'identification rapide et de haute débit d'enzymes actives, avec une manipulation minimale. Détection d'activité est assez sensible, et reflète qualitativement la quantité d'activité au sein de la cellule. Sa facilité d'utilisation rend cette méthode convient à un large éventail de bibliothèques enzyme, seulement limité par l'expression fonctionnelle dans E. coli. Par ailleurs, le dépistage de ce type d'activité n'est pas limitée au…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Gordon and Betty Moore Foundation, et par l'Initiative UNCF / Merck sciences.
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
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