הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em
Summary
אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי ב<em> א coli.</em> השיטה מסתמכת על readout ויזואלית פשוטה של השפלה המצע, אינו דורש טיהור האנזים, והיא ניתנת להרחבה. זה מאפשר הקרנה מהירה של ספריות גדולות של וריאנטים של האנזים.
Abstract
Cellulase אנזימים (endoglucanases, cellobiohydrolases, ו β-glucosidases) hydrolyze תאית לסוכרים רכיב, אשר בתורו יכול להיות מומר כהלים דלק 1. הפוטנציאל הידרוליזה אנזימטית של ביומסה cellulosic לספק אנרגיה מתחדשת הגביר את המאמצים מהנדס cellulases עבור 2 דלק חסכוני הייצור. עניין מיוחד הם cellulases פטרייתי 3-8, אשר כבר נמצאים בשימוש תעשייתי עבור מזונות ועיבוד טקסטיל.
זיהוי וריאנטים פעיל בין ספריה של cellulases מוטציה הוא קריטי לתהליך ההנדסה; מוטנטים פעילים ניתן לבדוק נוספת תכונות משופרות ו / או נתון mutagenesis נוספים. הנדסה יעיל של cellulases פטרייתי כבר הקשו על ידי היעדר כלים גנטית אורגניזמים מקומיים על ידי קשיים בהבעת האנזימים המארחים Heterologous. לאחרונה, פיתח Morikawa ועמיתיו שיטה לביטוי ב E. coli התחומים הקטליטית של endoglucanases מ ח jecorina 3,9, פטריות תעשייתי חשוב עם יכולת להפריש cellulases בכמויות גדולות. פונקציונלית E. הביטוי coli כבר דווח על cellulases מן פטריות אחרים, כולל Macrophomina phaseolina 10 ו Phanerochaete chrysosporium 11-12.
אנו מציגים שיטה ההקרנה תפוקה גבוהה של פעילות endoglucanase פטרייתי ב E. coli. (איור 1) שיטה זו משתמשת חיידקים המשותף צבען האדום קונגו (CR) כדי להמחיש השפלה אנזימטית של תאית carboxymethyl (CMC) על ידי תאים גוברת על בינוני מוצק. Assay פעילות דורשת ריאגנטים זולה, מניפולציה מינימלית, נותן תוצאות חד משמעיות כמו אזורי השפלה ("הילות") במקום מושבה. למרות מדד כמותי של הפעילות האנזימטית לא ניתן לקבוע לפי שיטה זו, מצאנו כי גודל הילה בקורלציה עם הפעילות האנזימטית הכולל בתא. אפיון נוסף של שיבוטים חיובי הפרט יקבע, כושר חלבון יחסית.
מסורתית חיידקי כל CMC / CR תא פעילות מבחני 13 לערב לשפוך CMC אגר המכיל על מושבות, אשר כפופה זיהום צולב, או תרבויות דוגרים בבארות אגר CMC, המהווה פחות נגישה ניסויים בקנה מידה גדול. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול משופר משנה לשטוף שיטות קיימות 14 לפעילות cellulase: התאים גדלו על צלחות אגר CMC מוסרים לפני מכתים CR. פרוטוקול שלנו מפחית באופן משמעותי את זיהום צולבות היא מדרגית, המאפשר הקרנת מהירה של אלפי שיבוטים. בנוסף ח אנזימים jecorina, יש לנו הביע הוקרן וריאנטים endoglucanase מן aurantiacus Thermoascus ו Penicillium decumbens (שמוצג באיור 2), טוען כי פרוטוקול זה הוא ישים אנזימים מתוך מגוון רחב של אורגניזמים.
Protocol
Discussion
פרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר תפוקה גבוהה של אנזימים פעילים, עם מניפולציה מינימלית. איתור פעילות רגיש למדי, איכותית משקף את היקף הפעילות בתוך התא. קלות השימוש שעושה שיטה זו מתאימה למגוון רחב של ספריות האנזים, מוגבל רק על ידי ביטוי פונקציונלית E. coli. יתר על כ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי גורדון ובטי מור קרן, ועל ידי היוזמה המדע UNCF / מרק.
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
Referências
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, . Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
