Effektiv Gene Delivery i flera CNS territorierna Använda I Utero Elektroporation
Summary
I livmodern elektroporation möjliggör snabb genen leverans i ett rumsligt och tidsmässigt-kontrollerat sätt i utvecklingsländerna centrala nervsystemet (CNS). Här beskriver vi en mycket anpassningsbar i livmodern elektroporering protokoll som kan användas för att leverera uttryck konstruktioner i flera embryonala CNS-domäner, inklusive telencephalon, diencephalon och näthinnan.
Abstract
Förmågan att manipulera genuttryck är hörnstenen i dagens moderna experimentella embryologi, vilket leder till att klarlägga flera utvecklingsbanor. Flera kraftfulla och väl etablerade transgena tekniker finns tillgängliga för att manipulera nivåer genuttryck i musen, vilket möjliggör generering av både förlust och vinst-of-funktionen modeller. Men den generation av musen transgena både kostsamt och tidskrävande. Alternativa metoder för genmanipulation har därför fått stor eftersträvas. I livmodern elektroporation är en metod för gen leverans till levande musembryon 1,2 att vi framgångsrikt har anpassat 3,4. Det är till stor del bygger på framgången för i ovo elektroporering teknik som ofta används i chick 5. Kortfattat är DNA injiceras i öppna ventriklar av den växande hjärnan och tillämpningen av en elektrisk ström ger upphov till bildning av övergående porer i cellens membran, som möjliggör upptag av DNA in i cellen. I våra händer, kan embryon vara effektivt electroporated så tidigt som embryonala dag (E) 11,5, medan inriktningen av yngre embryon skulle kräva ett ultraljud-styrda mikroinjektion protokoll, som tidigare beskrivits 6. Omvänt är E15.5 den senaste fasen kan vi enkelt electroporate, på grund av uppkomsten av parietala och frontala ben differentiering, vilket försvårar mikroinjektion in i hjärnan. Däremot är näthinnan tillgänglig till slutet av fosterutveckling. Embryon kan samlas vid någon tidpunkt under hela embryonal-eller tidiga postnatala perioden. Injektion av en reporter konstruktion underlättar identifieringen av transfekterade cellerna.
Hittills har i livmodern elektroporering varit mest använda för analys av hjärnbarkens utveckling 1,2,3,4. Nyare studier har riktat in den embryonala näthinnan 7,8,9 och Thalamus 10,11,12. Här presenterar vi en modifierad i livmodern elektroporering protokoll som lätt kan anpassas för att rikta olika områden av den embryonala CNS. Vi ger belägg för att med hjälp av denna teknik kan vi rikta den embryonala telencephalon, diencephalon och näthinnan. Representativa resultat presenteras, först som visar användningen av denna teknik att införa konstruktioner DNA uttryck i de laterala ventriklarna, tillåter oss att övervaka stamfader mognad, differentiering och migration i den embryonala telencephalon. Vi visar också att denna teknik kan användas för mål-DNA till diencephalic områdena kring den 3: e ventrikeln, vilket gör att flyttvägar att differentiera nervceller i diencephalic kärnor som skall övervakas. Slutligen visar vi att användningen av micromanipulators ger oss möjlighet att exakt införa DNA-konstruktioner i små målområden, inklusive subretinal utrymme, tillåter oss att analysera effekterna av att manipulera genuttryck på näthinnan utveckling.
Protocol
Discussion
I livmodern elektroporation kan användas för att analysera en mängd olika utvecklingsprocesser. Till exempel kan transfektion av reporter gener som GFP, mCherry eller alkaliska fosfataser tillgripas för att genomföra härstamning spårning och neuronala experiment migration. Alternativt kan Cre recombinase vara tillfälligt uttryck för att selektivt eliminera en floxed allel hos ett rumsligt-och / eller tidsmässigt-kontrollerat sätt. Dessutom kan shRNA eller dominerande negativa konstruktioner vara elec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Eva Hadzimova, Pierre Mattar och Christopher Kovach för sitt inledande arbete att etablera i livmodern elektroporering teknik i CS labbet. Detta arbete har finansierats av en kanadensisk Institute of Health Research (CIHR) bevilja (MOP 44.094) och CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Team Grant (00.933-000) till CS och ett Alberta Barnsjukhuset Research Foundation Bidrag till DMK. RD stöddes av en CIHR Kanada Hope Scholarship är RC stöds av en FFB utbildningsbidrag och LML stöddes av en CIHR Training Grant i genetik och barns utveckling.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
Referências
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
- Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
