Summary

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Published: September 26, 2011
doi:

Summary

Quantificar os níveis de HIV-1 RNA no plasma e seqüenciamento única HIV-1 genomas de indivíduos com carga viral abaixo do limite de detecção (50-75 cópias / ml) é difícil. Aqui nós descrevemos como extrair e quantificar RNA viral no plasma usando um ensaio de PCR em tempo real, que de forma confiável medidas HIV-1 RNA até 0,3 cópias / ml e como amplificar genomas virais por seqüenciamento do genoma único, a partir de amostras com cargas virais muito baixas.

Abstract

Amplificar genes virais e quantificar HIV-1 RNA do HIV-1 indivíduos infectados com cargas virais abaixo do limite de detecção por ensaios padrão (abaixo de 50-75 cópias / ml) é necessário ter uma visão para a dinâmica viral e interações hospedeiro do vírus em pacientes que naturalmente controlar a infecção e aqueles que estão em terapia anti-retroviral combinada (TARC).

Aqui nós descrevemos como para amplificar genomas virais por uma única seqüenciamento do genoma (o protocolo SGS) 13, 19 e como quantificar com precisão HIV-1 RNA em pacientes com baixa carga viral (a cópia de um único ensaio (SCA) protocolo) 12, 20.

O ensaio de um único exemplar é um real-time PCR com sensibilidade, dependendo do volume de plasma sendo ensaiadas. Se um genoma único vírus é detectado em 7 ml de plasma, então o número de cópias de RNA é de 0,3 cópias / ml. O ensaio tem um teste de controlo interno para a eficiência de extração de RNA, e controles para a amplificação de DNA ou possível contaminação. Amostras de pacientes são medidos em triplicata.

O seqüenciamento do genoma de um único ensaio (SGS), hoje amplamente utilizado e considerado como não-trabalho intensivo 3, 7, 12, 14, 15, é um ensaio por diluição limitante, em qual ponto de extremidade produto diluído cDNA é espalhada sobre uma de 96 poços prato. De acordo com uma distribuição de Poisson, quando menos de 1 / 3 dos poços dão produto, há uma chance de 80% resultante do produto de PCR de amplificação sendo a partir de uma única molécula de cDNA. SGS tem a vantagem sobre a clonagem de não ser submetido a reamostragem e não ser influenciada por PCR-introduzido recombinação 19. No entanto, o sucesso de amplificação da SCA e SGS dependem desenho de primers. Ambos os ensaios foram desenvolvidos para HIV-1 subtipo B, mas pode ser adaptado para outros subtipos e em outras regiões do genoma de primers mudando, sondas, e padrões.

Protocol

1. Extração de RNA a partir de grandes volumes de plasma Uma visão geral do ensaio de cópia única (SCA) eo único seqüenciamento do genoma (SGS) protocolo são fornecidos nas Figuras 1 e 2. Para obter 7 ml de plasma, spin aproximadamente 14 ml de sangue foram coletadas em 15 ml de EDTA (não heparina) tubos de coleta a 2.600 xg por 15 minutos sem travões. Pipeta plasma (certificando-se de evitar a camada de revestimento buffy) em tubos de 15 ml. Se RNA está sendo…

Discussion

HIV-1 indivíduos infectados em tratamento antiretroviral combinada (TARC) ou que naturalmente controlar a infecção têm cargas virais muito baixas, normalmente cerca de 1 cópia por ml de plasma 4, 11, 12, 17, 18. Carga viral em pacientes com controle natural, muitas vezes oscilam em torno de um conjunto individual ponto 1, 2, 17. A sensibilidade dos ensaios aqui descritos é altamente dependente do volume de entrada de plasma. Geralmente, temos vindo a trabalhar com 7 ml de plasma, mas os resul…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de reconhecer os pacientes que participaram nos estudos de muitos de HIV-1.

JMC era um professor da pesquisa da Sociedade Americana de Câncer com o apoio da FM Kirby Foundation.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue number Comments
Random hexamers (500 ug/ml) Promega C118A  
Taqman buffer A Applied Biosystems 4304441  
RNAsin (40 U/ul) Promega N211B  
RT enzyme (200 U/ul) Strategene 600107-51  
Amplitaq Gold DNA polymerase Applied Biosystems 4311814 6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM Invitrogen AM9855G  
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul Invitrogen 18080-044  
Superscript III 10X buffer Invitrogen   comes with the enzyme
DTT 100 mM Invitrogen   comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul Invitrogen 11304-102  
10X High Fidelity PCR Buffer Invitrogen 11304-102 comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml Ambion 2546  
Guanidinium Thiocyanate solution 6M FlukaBiochemica 50983  
Glycogen 20 mg/ml Roche 10901393001  
Isopropanol Sigma-Aldrich 19516  
Ethanol 70% Sigma-Aldrich E702-3  
Molecular grade water Gibco/Invitrogen 10977-015  
dNTPs (25 mmol each) Bioline BIO-39025  
Name of Euipment Company Catalogue number Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) Seaton Scientific 6041  
White Delrin crowns Seaton Scientific 4020 Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml Beckman 361642  
Hex driver ½ inc opening Seaton Scientific 4013  
cap removal tupe Seaton Scientific 4014  
5 ml serological pipettes Costar 4051  
Pipetboy any    
15 ml Transfer pipettes ISC Bioexpress P-5005-7  
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip VWR 14670-329  
15 ml centrifuge tubes Falcon    
1 ml centrifuge tubes any    
Tris buffer Saline tablets Sigma-Aldrich T5030-100TAB  
Ultracentrifuge and rotor Sorval 90SE and T-1270  
96-well PCR plates Biorad HSS-9601  
50 ml Reagent reservoir Costar 4870  
Microamp optical 96-well reaction plate Applied Biosystems N801-0560  
Optical plate covers Applied Biosystems 4333183  
MicroAmp Optical Compression Pad Applied Biosystems 4312639  
Microseal A film Biorad MSA-5001  
2 ml centrifuge tubes Any    
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) Invitrogen G-7008-01  
E-base (Invitrogen) Invitrogen EB-M03  

EDTA Collection tubes any brand

Referências

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Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A., Spindler, J., Maldarelli, F., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays. J. Vis. Exp. (55), e2960, doi:10.3791/2960 (2011).

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