Interação proteína-proteína testes é indispensável para dissecção de funcionalidade da proteína. Aqui, nós apresentamos uma In vitro Ensaio de proteína-proteína de ligação à sonda uma membrana de proteína-imobilizada com uma proteína solúvel. Este ensaio fornece um método confiável para testar a interação entre uma proteína insolúvel e uma proteína em solução.
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Artigo de método
Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Interações entre proteínas diferentes validar é vital para a investigação de suas funções biológicas em nível molecular. Existem vários métodos, tanto in vitro como in vivo, para avaliar a ligação às proteínas, e pelo menos dois métodos que complementam as deficiências do outro deve ser conduzido para obter conclusões confiáveis.
Para um ensaio in vivo, a complementação bimolecular de fluorescência ensaio (BiFC) representa a abordagem mais popular e menos invasivo que permite detectar a interação proteína-proteína dentro das células vivas, bem como identificar a localização intracelular de proteínas que interagem a 1,2. Neste ensaio, as metades não fluorescente N-e C-terminal da GFP, ou suas variantes são fundidos às proteínas testadas, e quando as duas proteínas de fusão são reunidos devido às interações das proteínas testadas ", o sinal fluorescente é reconstituído 06/03 . Porque seu sinal é facilmente detectável por microscopia de epifluorescência ou confocal, BiFC emergiu como uma poderosa ferramenta de escolha entre os biólogos para estudar sobre interações proteína-proteína em células vivas 3. Este ensaio, entretanto, às vezes pode produzir resultados falsos positivos. Por exemplo, o sinal fluorescente pode ser reconstituído por dois fragmentos de GFP dispostos, tanto quanto 7 nm um do outro devido a fechar embalagem, em um pequeno compartimento subcelular, e que, devido a interações específicas 7.
Devido a essas limitações, os resultados obtidos a partir de tecnologias de imagem ao vivo de células deve ser confirmado por uma abordagem independente, baseada em um princípio diferente para a detecção de interações proteína. Co-imunoprecipitação (IP-Co) ou glutationa transferase (GST) suspenso ensaios representam tais métodos alternativos que são comumente usados para analisar interações proteína-proteína in vitro. No entanto, estes ensaios iin, no entanto, as proteínas testado deve ser facilmente solúvel no buffer que supportsused para a reação de ligação. Portanto, interações específicas, envolvendo uma proteína insolúvel não podem ser avaliados por estas técnicas.
Aqui, nós ilustrar o protocolo para o ensaio overlay proteína de membrana de ligação, que contorna esta dificuldade. Nesta técnica, a interação entre as proteínas solúveis e insolúveis podem ser seguramente testado, porque uma das proteínas é imobilizado em uma matriz de membrana. Este método, em combinação com experimentos in vivo, tais como BiFC, fornece uma abordagem confiável para investigar e caracterizar as interações entre proteínas fielmente solúveis e insolúveis. Neste artigo, a ligação entre o vírus do mosaico do tabaco (TMV) proteína de movimento (MP), que exerce várias funções durante o transporte célula a célula-viral 8-14, e um interator planta recentemente identificado celulares, tabaco anquirina repetir proteína contendo (ANK ) 15, é demonstrado usando esta técnica.
Protocolo
1. Expressão e de extração das proteínas
- Diferencialmente tag as proteínas a ser testada para a sua detecção. Rótulo a proteína possa ser imobilizada na membrana (ProIM) com uma tag de um tamanho maior (por exemplo, GST) ea marca não fundido pode ser usado como um controle de imobilizado negativo (ProIMnc). Rótulo a proteína para ser usado como uma sonda solúvel (PROSOL) ou com uma grande ou uma pequena etiqueta. Fusível a mesma marca de uma proteína de controlo negativo adequado solúvel (ProSOLnc) e incluir no ensaio de interação para confirmar a especificidade da ligação detectado.
- Escolher o sistema de expressão de proteína para expressar prot....
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Discussão
Esta abordagem é adequada para testar interações proteína-proteína entre as combinações das proteínas, quando pelo menos um dos quais as proteínas é facilmente solúvel no buffer de ligação, e foi aplicado com sucesso em outra combinação de proteínas 17,18. O iInteractions entre as proteínas que são insolúveis nestas condições não pode ser testada por este protocolo.
Além disso, redobrando bem-sucedida de ProIM é fundamental para o ensaio. Lavar a membrana em TBS após a electrotran.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O trabalho em nosso laboratório é suportada por concessões do NIH, National Institute of USDA para Agricultura e Alimentação, NSF, BARD, DOE, e BSF para VC
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Kit ensaio de proteína | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase cocktail inibidor | SIGMA | S8820 | |
| Mini-PROTEAN sistema | Bio-RAD | 165-8000 | |
| Semi-seco western blotting SD sistema electrotransfer | Bio-RAD | 170-3940 | |
| Anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rabanete de cavalo | GenScript | A00098 | |
| Anti-GST anticorpo policlonal de coelho | GenScript | A00097 | |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 | |
| BioTrace, NT membrana de transferência de nitrocelulose | Pall Scientific | 27377-000 | |
| Immobilon ocidental substrato quimioluminescente HRP | Millipore | WBKL S0 050 |
Referências
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V.
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Reimpressões e permissões
