La investigación de la motilidad células ciliadas externas, con una combinación de la estimulación externa alterna de campo eléctrico de alta velocidad y Análisis de Imágenes

Summary

Un método fiable para investigar células ciliadas externas (OHC) las respuestas de móviles, incluyendo electromotility, motilidad lenta y flexión, se describe. Motilidad OHC es provocado por la estimulación con un campo externo eléctrica alterna, y el método tiene la ventaja de la grabación de imágenes a alta velocidad, la iluminación basada en LED, y el software de última generación de imágenes de análisis.

Abstract

OHCS son cilíndricas células sensoriomotora situado en el órgano de Corti, el órgano de la audición en el oído interno de mamíferos. El nombre de "células ciliadas" deriva de su paquete de características apical de los estereocilios, un elemento crítico para la detección y transducción de energía de sonido ^1. OHCS son capaces de cambiar de forma alargada, se acortan y doblar-en respuesta a la estimulación eléctrica, mecánica y química, una respuesta motora se considera crucial para la amplificación de las señales acústicas coclear ^2.

Estimulación induce OHC dos respuestas diferentes móviles: i) electromotility, la motilidad rápida aka, cambios en la longitud en el rango de microsegundos derivados de propulsión eléctrica, cambios conformacionales en proteínas motoras densamente empaquetadas en OHC membrana plasmática, y ii) la motilidad lenta, los cambios de forma en el milisegundos a segundos amplia participación de la reorganización del citoesqueleto ^{2, 3.} OHC flexión se asocia con electromotility, y el resultado tanto de una distribución asimétrica de proteínas motoras en la membrana plasmática lateral, o la estimulación eléctrica asimétrica de las proteínas de motor (por ejemplo, con un campo eléctrico perpendicular al eje longitudinal de las células) ^4. Estímulos mecánicos y químicos inducen respuestas móviles esencialmente lenta, a pesar de los cambios en las condiciones iónicas de las células y / o su entorno también puede estimular la membrana plasmática incrustado proteínas motoras ^{5, 6.} Dado que las respuestas OHC móviles son un componente esencial del amplificador coclear, el análisis cualitativo y cuantitativo de esas respuestas en las frecuencias acústicas móviles (aproximadamente desde 20 Hz a 20 kHz en los seres humanos) es un asunto muy importante en el campo de la audición de investigación ^7.

El desarrollo de nueva tecnología de imágenes que combina alta velocidad de cámaras de video, los sistemas de LEDs de iluminación, y un sofisticado software de análisis de imagen ofrece ahora la posibilidad de realizar estudios cualitativos y cuantitativos fiables de la respuesta de los móviles OHCS aislado a un campo externo eléctrica alterna (EAEF) ^8. Esta es una técnica sencilla y no invasiva que evita la mayor parte de las limitaciones de los enfoques anteriores ^9-11. Por otra parte, el sistema de iluminación basados ​​en LED proporciona brillo extremo con insignificantes los efectos térmicos de las muestras y, debido a la utilización de la microscopía de vídeo, resolución óptica es de al menos 10 veces mayor que con las técnicas convencionales de microscopía de luz ^12. Por ejemplo, con el montaje experimental se describe aquí, los cambios en la longitud de la célula de alrededor de 20 nm puede ser rutinaria y detectar con seguridad en las frecuencias de 10 kHz, y esta resolución puede mejorarse aún más en las frecuencias más bajas.

Estamos seguros de que este enfoque experimental ayudará a ampliar nuestra comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la motilidad OHC.

Protocol

1. El aislamiento de OHCS Iniciar este procedimiento por la extracción de los huesos temporales cobayas, ratones o su modelo de mamíferos. A continuación, abra los huesos temporales utilizando una pinza de martillo con el fin de exponer a la cóclea, y sumérgelas en Leibovitz L-15. Eliminar el exceso de hueso con cuidado, manteniendo la cubierta ósea intacta. Considerando que este es un procedimiento general aplicable a los huesos temporales de otras especies de mamíferos, pequeños cambios en…

Discussion

El método experimental que aquí se presenta permite estimar las respuestas OHC móviles en el rango de kHz sin ningún tipo de restricción al movimiento de la célula. Diferentes protocolos de estimulación, marcadores adicionales (microesferas), así como los cambios en la orientación de la celda con respecto al campo eléctrico, hacen que sea posible investigar nuevos aspectos de la motilidad OHC con un nivel de detalle que antes eran inaccesibles. Otros métodos, como por ejemplo los que utilizan fotodiodos ^…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Leibovitz’s L-15	Gibco	21083
Collagenase (Type 4)	Sigma-Aldrich	C5138	1mg/mL in L-15