قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

Summary

هذه المادة سوف تركز على جيل من الأديم الباطن كبدي الإنسان من الجنينية البشرية السكان الخلايا الجذعية.

Abstract

على الرغم من التقدم في النمذجة سمية الدواء الإنسان ، وفشل العديد من المركبات خلال التجارب السريرية وذلك بسبب الآثار الجانبية غير المتوقعة. تكلفة دراسات سريرية كبيرة ، ولذلك فمن الضروري أن يتم تطوير شاشات أكثر السموم التنبؤي ونشرها في وقت مبكر من تطوير العقاقير (Greenhough وآخرون 2010). خلايا الكبد البشرية تمثل النموذج الذهب القياسية الحالية لتقييم سمية الدواء ، بل هي مورد محدود الذي يحمل وظيفة متغير. ولذلك ، يعمل بشكل روتيني استخدام خطوط الخلايا خلد ونماذج الأنسجة الحيوانية بسبب الوفرة. في حين أن كلا من مصادر إعلامية ، تقتصر وظيفة من قبل الفقراء ، وتقلب الأنواع و / أو عدم الاستقرار في الثقافة (Dalgetty وآخرون 2009). الخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية) هي مصدر بديل للجاذبية الإنسان مثل خلايا الكبدية (ثوابت قانون هنري هي) (ميدين وآخرون 2010). الأمنية قادرة على تجديد الذات والتمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجسدية الموجودة في البالغين ، وتمثل بالتاليمصدر لا ينضب من الخلايا يحتمل أن تكون متباينة. وضعنا الداخلي التي هي بسيطة وفعالة للغاية ، قابلة للأتمتة وثوابت قانون هنري هي غلة الإنسان وظيفية (هاي وآخرون 2008 ؛ فليتشر وآخرون 2008 ؛ حنون وآخرون 2010 ؛ باين وآخرون 2011 وهاي وآخرون 2011). نعتقد دينا التكنولوجيا سيؤدي إلى تحجيم الإنتاج من ثوابت قانون هنري هي لاكتشاف المخدرات ، والنمذجة المرض ، والبناء من خارج الخلية الجسدية الأجهزة وربما علاجات زرع القائمة.

Protocol

1. تحضير أولي لجميع الأرصدة الكيماوية وطلاء بلستيكور الثقافة على أن تتم جميع الخطوات في نسيج الثقافة هود في ظل ظروف معقمة. إعداد الإنسان الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية (hbFGF) <ol style=…

Discussion

وقد طورنا نموذجا بسيطا ، متجانسة وقابلة للتكرار للغاية في المختبر لتوليد مستويات متدرجة من ثوابت قانون هنري هي الإنسان. وقد تم التحقق من صحة النموذج لدينا من قبل عدد من المختبرات الخارجية المتعاونة. نحن نصنف بشكل روتيني ثوابت قانون هنري هي الخلايا الجذعية المست…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Tipo	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)