Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Summary

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Abstract

Ondanks de vooruitgang in het modelleren van menselijke geneesmiddelen toxiciteit, veel stoffen niet tijdens klinische studies als gevolg van onverwachte bijwerkingen. De kosten van de klinische studies substantieel zijn, daarom is het essentieel dat meer voorspellende toxicologie schermen zijn ontwikkeld en vroeg ingezet in de ontwikkeling van geneesmiddelen (Greenhough et al., 2010). Humane hepatocyten vertegenwoordigen de huidige gouden standaard model voor het evalueren van drugs toxiciteit, maar zijn een beperkte hulpbron die variabele functie vertonen. Daarom zijn het gebruik van onsterfelijk gemaakte cellijnen en dierlijk weefsel modellen routinematig ingezet als gevolg van hun overvloed. Hoewel beide bronnen zijn informatief, worden ze beperkt door een slechte werking, soorten variabiliteit en / of instabiliteit in de cultuur (Dalgetty et al. 2009). Pluripotente stamcellen (PSC's) zijn een aantrekkelijk alternatief bron van menselijke hepatocyten achtige cellen (HLCS) (Medine et al. 2010). PSC's zijn in staat om zelfvernieuwing en differentiatie van alle somatische cellen soorten gevonden in de volwassen en daarmee vertegenwoordigeneen potentieel onuitputtelijke bron van gedifferentieerde cellen. We hebben een procedure ontwikkeld die eenvoudig, zeer efficiënt, vatbaar voor automatisering en levert functionele menselijke HLCS (Hay et al., 2008; Fletcher et al. 2008; Hannoun et al. 2010; Payne et al. 2011 en Hay et al. 2011). Wij geloven dat onze technologie zal leiden tot de schaalbare productie van HLCS voor drug discovery, ziekte modelleren, de bouw van extra-lichamelijke-apparaten en eventueel cell-based therapieën transplantatie.

Protocol

1. Eerste voorbereiding van alle chemische voorraden en coating van de cultuur plasticware Alle stappen die moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. De voorbereiding van de menselijke basis fibroblast groeifactor (hbFGF) Bereid 10% BSA-oplossing in PBS en filtreer door een 0,22 urn filter. Van de 10% BSA-oplossing bereiden een 0,2% BSA-oplossing. Voeg 10 mL 0,2% BSA solution/100 ug hbFGF. Pre-nat een 0,22…

Discussion

We hebben een eenvoudig, homogeen en zeer reproduceerbaar in vitro model om schaalbare niveaus van menselijke HLCS te genereren. Ons model is gevalideerd door een aantal externe samenwerkende laboratoria. We routinematig karakteriseren van stamcellen afgeleid HLCS het gebruik van onze in-house gereedschapskist van de ontwikkelings-markers en de lever specifieke functionele assays (waarvan de meeste in de handel verkrijgbaar). De kritische stappen in ons proces zijn: het behoud van stamcellen pluripotentie, de m…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Tipo	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)