Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Summary

Cet article se concentrera sur la génération de l'endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

Abstract

Malgré les progrès dans la toxicité des médicaments de modélisation humaine, de nombreux composés échouent lors des essais cliniques en raison d'effets secondaires imprévus. Le coût des études cliniques sont considérables, il est donc essentiel que plusieurs écrans toxicologie prédictive sont développées et déployées au début du développement de médicaments (Greenhough et al 2010). Hépatocytes humains représentent le modèle actuel de l'or standard pour évaluer la toxicité des médicaments, mais ils sont une ressource limitée qui présentent fonction variable. Par conséquent, l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées et des modèles de tissus animaux sont couramment employées en raison de leur abondance. Alors que les deux sources sont informatifs, ils sont limités par la fonction pauvres, la variabilité des espèces et / ou d'instabilité dans la culture (Dalgetty et al 2009). Les cellules souches pluripotentes (PSC) sont une source intéressante alternative d'hépatocytes humains comme des cellules (CLH) (Medine et al 2010). CPP sont capables d'autorenouvellement et de différenciation à tous les types de cellules somatiques dans l'adulte et représentent ainsiune source potentiellement inépuisable de cellules différenciées. Nous avons développé une procédure qui est simple, très efficace, se prêtent à l'automatisation et les rendements fonctionnels CLH humaine (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 et Hay et al 2011). Nous croyons que notre technologie peut conduire à la production évolutive de CLH pour la découverte de médicaments, la modélisation des maladies, la construction d'appareils extra-corporelle et, éventuellement, les thérapies cellulaires de transplantation base.

Protocol

1. La préparation initiale de tous les stocks de produits chimiques et le revêtement de la culture en matière plastique Toutes les étapes à réaliser dans une hotte de culture de tissus dans des conditions aseptiques. Préparation du facteur humain de croissance fibroblastique basique (hbFGF) Préparer une solution BSA 10% dans le PBS et filtrer à travers un filtre de 0,22 um. De la solution à 10% de BSA préparer une solution à 0,2% de BSA. Ajout…

Discussion

Nous avons développé un modèle simple, homogène et hautement reproductibles in vitro pour générer des niveaux évolutifs du CLH humaine. Notre modèle a été validé par un certain nombre de laboratoires externes collaborent. Nous avons régulièrement de caractériser des cellules souches dérivées CLH utilisant notre boîte à outils dans la maison de marqueurs spécifiques de développement et des tests fonctionnels du foie (dont la plupart sont disponibles dans le commerce). Les étapes essentielles…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Tipo	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)