मानव भ्रूण स्टेम सेल जनसंख्या से hepatocyte तरह प्रकोष्ठों के मजबूत पीढ़ी
Summary
इस लेख मानव भ्रूण स्टेम सेल आबादी से मानव यकृत अन्तस्त्वक् की पीढ़ी पर ध्यान दिया जाएगा.
Abstract
मॉडलिंग मानव दवा विषाक्तता में प्रगति के बावजूद, कई यौगिकों नैदानिक परीक्षणों के दौरान unpredicted दुष्प्रभाव कारण असफल. नैदानिक अध्ययन की लागत पर्याप्त हैं, इसलिए यह जरूरी है कि अधिक पेशीनगोई विष विज्ञान स्क्रीन विकसित कर रहे हैं पर जल्दी दवा के विकास (Greenhough एट अल 2010) में तैनात है. मानव hepatocytes दवा विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए वर्तमान सोने के मानक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन एक सीमित संसाधन है कि चर समारोह प्रदर्शन कर रहे हैं. इसलिए, अमर सेल लाइनों और पशु ऊतक मॉडल का उपयोग नियमित उनकी बहुतायत की वजह से नियोजित कर रहे हैं. जबकि दोनों स्रोतों जानकारीपूर्ण हैं, वे गरीब समारोह, प्रजातियों परिवर्तनशीलता और / या संस्कृति में अस्थिरता (Dalgetty एट अल 2009) द्वारा सीमित हैं. Pluripotent स्टेम सेल (PSCs) मानव hepatocyte की कोशिकाओं की तरह एक आकर्षक वैकल्पिक स्रोत (HLCs) (२०१० Medine एट अल) कर रहे हैं. PSCs आत्म नवीकरण और सभी दैहिक सेल वयस्क में पाया प्रकार के भेदभाव के सक्षम हैं और इस तरह का प्रतिनिधित्वविभेदित कोशिकाओं का एक संभावित अटूट स्रोत. हम एक प्रक्रिया है कि सरल, अत्यधिक कुशल स्वचालन और कार्यात्मक मानव (HLCs, फ्लेचर एट अल 2008, Hannoun एट अल 2010; पायने एट अल 2011 और सूखी घास एट अल 2011 सूखी घास एट अल 2008) की पैदावार करने के लिए उत्तरदायी है विकसित किया है. हमें विश्वास है कि हमारी प्रौद्योगिकी दवाओं की खोज, रोग मॉडलिंग, अतिरिक्त भौतिक उपकरणों के निर्माण और संभवतः सेल आधारित प्रत्यारोपण उपचार के लिए HLCs की स्केलेबल उत्पादन के लिए नेतृत्व करेंगे.
Protocol
Discussion
हम एक सरल, सजातीय और इन विट्रो में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानव HLCs स्केलेबल स्तर उत्पन्न मॉडल विकसित किया है. हमारे मॉडल बाहरी सहयोग प्रयोगशालाओं के एक नंबर के द्वारा मान्य किया गया ह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ. सूखी घास का एक RCUK फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, डॉ. पश्चिम सर्जरी विभाग द्वारा समर्थित किया गया था, डॉ. Medine BHF कोर कोष से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, श्री Lucendo Villarin Baltasar MRC पीएचडी Studenship द्वारा समर्थित किया गया. डॉ. झोउ चीनी सरकार की ओर से एक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
Matrigel coating plates and flasks
- Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
- KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
- Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
- Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)
hESC Maintenance
- Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
- BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
- Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
Passaging hESCs with collagenase
- Confluent well or flask of hESCs.
- Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
- Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
- Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
- Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
- Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).
Differentiation of hESCs to hepatic endoderm
- RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
- B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
- Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
- Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
- KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
- KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
- Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
- β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
- DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
- Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
- Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
- Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
- Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
- Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
- L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
- Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
- Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
- Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
- Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)
Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm
Immunostaining
- Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
- PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
- Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
- Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
- Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
- Ethanol
- Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
- Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
- MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
| Primary antibodies | |||
| Antigen* | Tipo | Supplier | Dilution |
| ALB | Mouse Monoclonal | Sigma Aldrich | 1/500 |
| E-Cadherin | Mouse Monoclonal | Millipore | 1/100 |
| α-fetoprotein | Mouse Monoclonal | Sigma | 1/500 |
| SSEA-4 FITC | Mouse Monoclonal | Biolegend | 1/100 |
| IgG | Mouse Monoclonal | DAKO | 1/500 |
| Secondary antibodies | |||
| Anti-mouse FITC conjugate | Goat Monoclonal | Invitrogen | 1/400 |
Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.
Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)
Cytochrome P450 Assays
- p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
- White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
- BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
- Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)
Referências
- Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
- Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
- Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
- Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
- Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
- Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
- Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
- Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).
