ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

Summary

この記事では、ヒト胚性幹細胞集団からヒト肝内胚葉の発生に焦点を当てます。

Abstract

モデリング人間の薬物毒性の進歩にもかかわらず、多くの化合物は、予期せぬ副作用のために臨床試験中に失敗する。臨床試験の費用はかなりのもの、従ってそれはより多くの予測毒性学スクリーンを開発し、薬剤開発（Greenhoughら2010）で早い段階で展開されていることが不可欠です。ヒト肝細胞は、薬物の毒性を評価するための現在のゴールドスタンダードモデルを表していますが、変数機能を発揮する限られたリソースです。そのため、不死化細胞株や動物の組織モデルの使用が日常的に多量のために採用されている。両方のソースが有益であるが、彼らは貧しい機能、種の変動および/または培養における不安定性（ダルゲティら2009）によって制限されています。多能性幹細胞（PSCは）細胞などのヒト肝細胞の魅力的な代替ソース（HLCs）（Medineら2010）です。 PSCは自己再生し、成人で見つかったすべての体細胞型へ分化することが可能であり、それによって表しています分化した細胞の潜在的に無尽蔵の源。我々は、自動化と収量機能性ヒトHLCs（;フレッチャーら2008; Hannounら2010; Payne氏ら2011年とヘイら2011ヘイら2008）の影響を受けやすい、高効率、簡単な手続きを開発した。私たちは、私たちの技術が創薬、疾病のモデリング、体外装置の建設とおそらく細胞ベースの移植療法のためのHLCsのスケーラブルな生産につながると信じています。

Protocol

1。すべての化学物質の株式や文化プラスチック容器のコーティングの初期準備すべてのステップは、無菌条件下で組織培養フード内で行われる。 人間の塩基性線維芽細胞増殖因子の調製（hbFGF） 0.22μmフィルターを通してPBSとフィルタで10％BSA溶液を調製します。 10％BSA溶液からの0.2％BSA溶液を調製。 10 mLの0.2％BSA solution/100μgのhbFGFを追加。 </…

Discussion

私たちは、人間のHLCsのスケーラブルなレベルを生成するために、単純な均質およびin vitroで再現性の高いモデルを開発した。我々のモデルは、外部の協力研究室の数によって検証されています。我々は日常的に発達マーカーと肝特異的機能アッセイ（これのほとんどが市販されている）の私達の家のツールボックスを使用して幹細胞由来のHLCsを特徴付ける。私たちのプロセスの重要な…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Tipo	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)