Robust Generation of hepatocytter-lignende celler fra humane embryonale Stem Cell pasientgrupper

Summary

Denne artikkelen vil fokusere på den generasjonen av menneskelig nedsatt endoderm fra humane embryonale stamceller populasjoner.

Abstract

Til tross for fremgang i modellering human narkotika toksisitet, mange forbindelser mislykkes i kliniske studier på grunn av uforutsette bivirkninger. Kostnaden for kliniske studier er store, derfor er det viktig at mer prediktiv toksikologi skjermer er utviklet og distribuert tidlig i legemiddelutvikling (Greenhough et al 2010). Humane hepatocytter representerer dagens gullstandarden modell for evaluering av narkotika toksisitet, men er en begrenset ressurs som viser variabel funksjon. Derfor er bruk av foreviget cellelinjer og animalsk vev modeller rutinemessig ansatt på grunn av sin overflod. Mens begge kilder er informative, de er begrenset av dårlig funksjon, arter variabilitet og / eller ustabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stamceller (PSCs) er et attraktivt alternativ kilde til menneskelig hepatocytter som celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs er i stand til selv fornyelse og differensiering for alle somatiske celletyper som finnes i den voksne og dermed representereren potensielt uuttømmelig kilde til differensierte celler. Vi har utviklet en prosedyre som er enkel, svært effektiv, mottagelig for automatisering og gir funksjonell human HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 og Hay et al 2011). Vi tror vår teknologi vil føre til skalerbar produksjon av HLCs for drug discovery, sykdom modellering, bygging av ekstra-corporeal enheter og muligens cellebaserte transplantasjon terapi.

Protocol

1. Initial utarbeidelse av alle kjemiske bestander og belegg av kultur plasticware Alle trinn skal utføres i en vevskultur hette under aseptiske forhold. Utarbeidelse av menneskelig grunnleggende fibroblast vekstfaktor (hbFGF) Forbered 10% BSA løsning i PBS og filtrere gjennom en 0,22 mikrometer filter. Fra 10% BSA løsning forberede en 0,2% BSA løsning. Tilsett 10 ml 0,2% BSA solution/100 mikrogram hbFGF. Pre-vått en 0,22 mikrometer filter …

Discussion

Vi har utviklet et enkelt, homogen og svært reproduserbare in vitro modell for å generere skalerbar nivåer av menneskelige HLCs. Vår modell har blitt validert av en rekke eksterne samarbeidende laboratorier. Vi rutinemessig karakterisere stamceller hentet HLCs bruke vår i huset verktøykasse av utviklingsforstyrrelser markører og lever spesifikke funksjonelle assays (de fleste som er kommersielt tilgjengelig). Den kritiske stadier i prosessen vår er: vedlikehold av stamcelle pluripotency, evnen til direk…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Tipo	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)