Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Summary

Denna artikel kommer att fokusera på skapandet av mänskliga nedsatt endoderm från mänskliga embryonala populationer stamceller.

Abstract

Trots framsteg i modellera människans läkemedelstoxicitet, många föreningar misslyckas under kliniska prövningar på grund av oförutsedda biverkningar. Kostnaden för kliniska studier är betydande, därför är det viktigt att mer prediktiva toxikologi skärmar utvecklas och distribueras tidigt i läkemedelsutveckling (Greenhough et al 2010). Humana hepatocyter representerar det nuvarande guldmyntfoten modell för utvärdering läkemedelstoxicitet, men är en begränsad resurs som uppvisar varierande funktion. Därför är användningen av förevigat cellinjer och djurmodeller vävnad rutinmässigt används på grund av sitt överflöd. Även om båda källorna är informativa, de är begränsade av dålig funktion, arter variabilitet och / eller instabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotenta stamceller (PSC) är ett attraktivt alternativ källa av mänskliga hepatocyte liknande celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSC kan självförnyelse och differentiering till alla somatiska celltyper som finns i vuxna och därmed representeraren potentiellt outtömlig källa av differentierade celler. Vi har utvecklat ett förfarande som är enkel, mycket effektiv, mottagliga för automatisering och ger funktionella mänskliga HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 och Hay et al 2011). Vi tror att vår teknologi kommer att leda till skalbar produktion av HLCs för läkemedelsutveckling, sjukdom modellering, konstruktion av extra fysiska enheter och eventuellt cellbaserade terapier transplantation.

Protocol

1. Första bearbetning av alla kemiska lager och ytbeläggning av kultur plasten Alla steg skall utföras i en vävnad kultur huva under aseptiska förhållanden. Beredning av människans grundläggande Fibroblast Growth Factor (hbFGF) Bered 10% BSA lösning i PBS och filtrera genom ett 0,22 ìm filter. Från 10% BSA Bered en 0,2% BSA lösning. Tillsätt 10 ml 0,2% BSA solution/100 mikrogram hbFGF. Pre-wet ett 0,22 ìm filter genom att filtrera …

Discussion

Vi har utvecklat en enkel, enhetlig och mycket reproducerbar in vitro-modell för att skapa skalbara nivåer av mänsklig HLCs. Vår modell har godkänts av ett antal externa samverkande laboratorier. Vi karakteriserar rutinmässigt stamceller härstammar HLCs använda vår i huset verktygslåda av utvecklingsstörningar markörer och lever specifika funktionella tester (varav de flesta kommersiellt tillgängliga). Den kritiska steg i vår process är: underhåll av stamceller pluripotens, förmågan att styra …

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Tipo	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)