Denne metoden for å isolere funksjonelle immunceller fra hjertet gir et alternativ til konvensjonelle metoder for collagenase fordøyelsen, noe som fører til uønskede immunceller aktivering, som resulterer i en redusert respons av disse cellene. Vår metode for isolering gir funksjonelle kardiale immune celler ved å unngå problemer knyttet til enzymatisk fordøyelse.
Cardiac immunceller er økende interesse for rollene de spiller i den patologiske remodeling i mange hjertesykdommer 1-5 Disse immunceller, som inkluderer mast celler, T-celler og makrofager;. Lagre og utgi en rekke biologisk aktive mediatorer inkludert cytokiner og proteaser som tryptase. 6-8 Disse mediatorer har vist seg å være sentrale aktører i ekstracellulær matrix metabolismen ved å aktivere matrix metalloproteinaser eller forårsaker kollagen opphopning av modulating den kardiale fibroblaster "funksjon. 9-11, men tilgjengelige teknikker for å isolere kardiale immunceller har vært problematisk fordi de bruker bakteriell collagenase å fordøye hjerteinfarkt vev. Denne teknikken fører til aktivering av immunceller og dermed tap av funksjon. For eksempel hjertestans mast celler blir betydelig mindre mottakelig for forbindelser som forårsaker degranulation. 12 Derfor har vi utviklet en teknikk som gjør det mulig for than isolering av funksjonelle kardiale immunceller som ville føre til en bedre forståelse av hvilken rolle disse cellene i hjertesykdom. 13, 14
Denne metoden krever en fortrolighet med den anatomiske plasseringen av rotte er xiphoid prosess, armhulen og falciform ligament, og perikard av hjertet. Disse landemerkene er viktig å øke suksessen av prosedyren og for å sikre en høyere avkastning av hjertestans immunceller. Disse isolerte hjertestans immunceller kan deretter brukes for karakterisering av funksjonalitet, phenotype, modenhet og co-kulturen eksperimenter med andre kardiale celler for å få en bedre forståelse av deres vekselvirkninger.
Denne metoden for å isolere hjertestans immunceller muliggjør analyse av deres funksjon, phenotype, og modenhet uten uønskede aktivering som vanligvis oppstår under en tradisjonell enzymatisk fordøyelse isolasjon teknikk. Den gjennomsnittlige totale antall celler oppnådd med denne teknikken er rundt 400 000 per rotte hjerte, og differensial flekker og flowcytometri analyse av disse cellene indikerer blandet populasjon av T-lymfocytter (~ 70%), makrofager (~ 12%) og mast celler med bruken av denne teknikken. (~ 12%…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en UNCF-Merck Graduate Science Research Dissertation Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute stipend RO1-HL-62228 (JSJ) og RO1-HL-073990 (JSJ).
Name of Reagent and Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Hanks’ Balanced Salt | Sigma | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
Antibiotic- Antimyotic | Gibco | 15240-062 | |
HEPES | Sigma | H3784 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3912 | |
250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermoscientific | 157-0020 | |
12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
Double Distilled Water |
Table of Specific Equipment:
Name of Reagent and Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
3-O Suture Silk Braided | Ethicon Products | SA64H | |
Small Animal Ventilator | CWE Incorporated | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
Hyclone | Thermoscientific | S300030.02 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 |