Isolering av Funksjonelle Cardiac immunceller

Summary

Denne metoden for å isolere funksjonelle immunceller fra hjertet gir et alternativ til konvensjonelle metoder for collagenase fordøyelsen, noe som fører til uønskede immunceller aktivering, som resulterer i en redusert respons av disse cellene. Vår metode for isolering gir funksjonelle kardiale immune celler ved å unngå problemer knyttet til enzymatisk fordøyelse.

Abstract

Cardiac immunceller er økende interesse for rollene de spiller i den patologiske remodeling i mange hjertesykdommer ^1-5 Disse immunceller, som inkluderer mast celler, T-celler og makrofager;. Lagre og utgi en rekke biologisk aktive mediatorer inkludert cytokiner og proteaser som tryptase. ^6-8 Disse mediatorer har vist seg å være sentrale aktører i ekstracellulær matrix metabolismen ved å aktivere matrix metalloproteinaser eller forårsaker kollagen opphopning av modulating den kardiale fibroblaster "funksjon. ^9-11, men tilgjengelige teknikker for å isolere kardiale immunceller har vært problematisk fordi de bruker bakteriell collagenase å fordøye hjerteinfarkt vev. Denne teknikken fører til aktivering av immunceller og dermed tap av funksjon. For eksempel hjertestans mast celler blir betydelig mindre mottakelig for forbindelser som forårsaker degranulation. ¹² Derfor har vi utviklet en teknikk som gjør det mulig for than isolering av funksjonelle kardiale immunceller som ville føre til en bedre forståelse av hvilken rolle disse cellene i hjertesykdom. ^{13, 14}

Denne metoden krever en fortrolighet med den anatomiske plasseringen av rotte er xiphoid prosess, armhulen og falciform ligament, og perikard av hjertet. Disse landemerkene er viktig å øke suksessen av prosedyren og for å sikre en høyere avkastning av hjertestans immunceller. Disse isolerte hjertestans immunceller kan deretter brukes for karakterisering av funksjonalitet, phenotype, modenhet og co-kulturen eksperimenter med andre kardiale celler for å få en bedre forståelse av deres vekselvirkninger.

Protocol

1. Utarbeidelse av Hanks 'Balance Salt Solution (HBSS) Autoclave 1 L glass beger, uteksaminert 1000 ml sylinder, og rør bar. Rekonstituer HBSS pulveret løsningen i autoklaveres 1 L glass beger til 900 ml merket med dobbelt destillert vann. Bland HBSS løsning med 3,4 g Hepes Na + salt og juster pH til en verdi mellom 7,35 til 7,41 ved hjelp av enten konsentrert HCl eller NaOH. Når ønsket pH er nådd og forblir stabil, tilsett 5 g bovint serum albumin til løsningen ved ro…

Discussion

Denne metoden for å isolere hjertestans immunceller muliggjør analyse av deres funksjon, phenotype, og modenhet uten uønskede aktivering som vanligvis oppstår under en tradisjonell enzymatisk fordøyelse isolasjon teknikk. Den gjennomsnittlige totale antall celler oppnådd med denne teknikken er rundt 400 000 per rotte hjerte, og differensial flekker og flowcytometri analyse av disse cellene indikerer blandet populasjon av T-lymfocytter (~ 70%), makrofager (~ 12%) og mast celler med bruken av denne teknikken. (~ 12%…

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483