一个发展到小鼠大脑的基因转移方法是通过使用一个独特的手术方法和特殊形状的电极的描述。这种独特的技术使转染的质粒DNA的时间和空间,这将有助于研究脑的发育许多神经学家。
为了了解在发育中的大脑,包括信号分子和轴突导向分子,当地的基因转移或淘汰需要的特定区域基因表达的功能。基因靶向敲或淘汰到局部地区是可能的执行,结合特定的综合招聘考试线,这是费力,成本高昂,耗时。因此,一个简单的转染法,在子宫内电穿孔技术,可以用短的时间内执行,就会得心应手的测试可能的候选基因功能的转基因动物的 1,2代前。此外,针对存在大脑里没有具体的综合招聘考试线在子宫内电领域,并会限制胚胎杀伤力3,4。在这里,我们提出了一个在子宫内电到发育中的大脑目标领域相结合的两种不同类型的简单和方便的基因转移电极的方法。首先,使用胚胎光纤光缆光电缆的独特持有方法,将小胚胎(E9.5)进行有针对性的DNA注射入脑室的解决方案和针式电极插入到目标的大脑区域5,6可见。 ,如大脑皮质区的图案出现在早期胚胎阶段,因此,这些早期从E9.5电作出了巨大贡献,了解整个地区的图案事件。其次,孔插入毛细管毛细血管的精确形状,防止子宫损伤。此外,钨和铂丝电极针的精确形状和削尖的使用砂纸,用指甲油 7,这是非常详细的描述在这个协议的方法绝缘。这种独特的技术允许进入大脑禁区的质粒DNA转染,将使小胚胎被电。这将有助于工作在非常早期的萌芽阶段,细胞分化,细胞迁移,轴突导向的许多科学家打开一个新窗口。此外,这种技术将允许科学家质粒DNA转染到深部的丘脑和下丘脑的地方并不多,特定区域的综合招聘考试行增益功能(GOF)或丧失功能(LOF)分析存在的,如大脑发育。
在这个协议中,我们只描述成一个小胚胎大脑使用不同形状的电极禁区pCAG EYFP转技术的好处。对于不同的启动子转染效率的比较如前所述,这表明细胞类型特异性 1 。不过,也有限制,如转染技术,只有短暂的变化取决于质粒,它不会有任何细胞特异性,这是难以控制转染细胞的数量。 ThereforeHowever此协议,与其他技术相结合,将进一步为不同的操作方法的可能性。首先,纳入细胞特异性启动子的质粒DNA,将使细胞类型,如神经元,神经胶质细胞和星形胶质细胞的特定的转染,。二,自染是短暂的,它是不适合那些希望在以后的生活中的基因的功能分析的科学家。因此,用转座质粒DNA整合到基因组的结合,将其转换成稳定转染8。下一步,采用四面体或TET关闭系统将有可能操纵的时间或在8个神经细胞的细胞类型特异性基因表达。另外,可以结合他莫昔芬诱导的Cre – ER(T)的重组酶9和记者小鼠10本议定书。
这个组织的广泛的辅助,将彻底改变在神经科学中所使用的实验设计。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由理化学研究所脑科学协会(BSI),人类前沿科学计划(HFSP)(批到TS)和理化学研究所少年副研究员计划(JRA的,授予MK)理化学研究所脑科学研究所(BSI),人类前沿科学计划(HFSP)(批到TS)和理化学研究所少年副研究员计划(JRA,授予MK)资助了这项工作。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M systems | 797600 |
bare platinum wire diameter 125 μm | A-M systems | 767000 |
Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 |
glass capillary tube | Stoelting | 50611 |
micromanipulator | KD Scientific | KDS310 |
scissors | ROBOZ | RS-5865 |
pulse generator | A-M Systems | Model 2100 |
9 mm autoclip | ROBOZ | RS-9260 |
gold-plated pins | WPI | 5482 |
RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |