إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة
Summary
pyrophosphates اينوزيتول تلعب دورا هاما في أمراض السرطان مثل الإنسان ، والسكري والسمنة ، إلا أن الآلية الدقيقة لعمل هو موضع خلاف. عدم وجود pyrophosphates اينوزيتول المتاحة تجاريا يجعل دراسات تفصيلية للمشاكل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لإنتاج وعزل ملليغرام من pyrophosphates اينوزيتول.
Abstract
Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.
Protocol
Discussion
غير محدودة بشدة استخدام بيروفوسفات اينوزيتول في الكيمياء الحيوية بسبب عدم توفر هذه المركبات التجارية وحساسية الفقيرة من طرق الكشف الحالية. مزيج من صفحة ، والذي تمكن من فصل الجزيئات التي تمتلك عدد مختلف من مجموعات الفوسفات ، وزرقة الطولويدين (الشكل 1) ، وصبغ متبدل اللون الذي يربط لمجموعات الفوسفات ، وتمكن من السهل اكتشاف الأشكال الإسوية pyrophoshate اينوزيتول فتح مجالات جديدة للبحث 20.
نفذت استخدام التكنولوجيا PAGE وصف لتنقية المنتجات بيروفوسفات اينوزيتول رد الفعل الأنزيمية outby إما 6 أو IP K1 VIP1 هو بسيط ، طريقة اقتصادية والموثوق بها التي تسمح لإنتاج كميات كبيرة من الملكية الفكرية ذات جودة عالية 7. لا يقتصر على الطريقة الموصوفة أعلاه لعملية تنقية بسيطة للملكية الفكرية 7 ولكن تعديلات طفيفة على البروتوكول صفها قد تسمح لتنقية مجموعة مختلفة من pyrophosphates اينوزيتول. ويمكن الكشف عن أعلى فسفرته الأشكال الإسوية بيروفوسفات اينوزيتول ، تحتوي على مجموعة الفوسفات أكثر من ثمانية باستخدام الملكية الفكرية (7) أو كميات مختلفة من 6 الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 20،6. ويمكن الكشف عن هذه pyrophosphates اينوزيتول من خلال زيادة طول تلطيخ الداخلي وتنقيته في وقت لاحق (القسم 3.2). علاوة على ذلك ، فإن استخدام الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 5 للتفاعل الأنزيمي السماح للتنقية PP – IP (5) وpyrophosphates اينوزيتول أخرى تحتوي على مجموعة الهيدروكسيل على الحلقة اينوزيتول.
في الختام ، وهذه الطريقة بسهولتها يسمح لتنقية موثوق بها كميات مليغرام من pyrophosphates اينوزيتول مع الأدوات المتاحة على نطاق واسع ، مما يفتح آفاقا جديدة لهذا الحقل البحوث المثيرة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ألف ريشيو عن التعليقات المفيدة وقراءة المخطوط. وأيد هذا العمل عن طريق تمويل البحوث الطبية (MRC) المجلس إلى خلية علم الأحياء وحدة الإنسان من قبل برنامج منح العلوم الحدودي (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
| GST-Vip1 | 17 | 17 |
| His-IP6K1 | 18 | 18 |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
| Temed | BDH | 43083G |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
| SpeedVac | Christ | 100218 |
| Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
Referências
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules?. J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B. Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers. Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
