Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.
מיו-אינוסיטול נמצא בטבע ללא שינוי או יותר derivates phosphorylated מורכבים. מבין האחרונים, שני הנפוץ ביותר התאים האיקריוטים הם pentakisphosphate אינוסיטול (IP 5) ו hexakisphosphate אינוסיטול (חומצה phytic IP או 6). IP ו-IP 5 6 הם מבשרי של מולקולות pyrophosphate אינוסיטול המכילים אחד או יותר אג"ח pyrophosphate 1. זירחון של ה-IP 6 מייצר diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 או PP-IP 5) ו bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP או 8 (PP) 2-IP 4). Pyrophosphates אינוסיטול היה מבודד מכל אורגניזמים אוקריוטים למד עד כה. בנוסף, שני מעמדות שונים של אנזימים האחראים סינתזה pyrophosphate אינוסיטול שמורים לאורך האבולוציה מאוד 2-4.
IP 6 קינאזות (IP 6 Ks) posses גמישות עצומה קטליטי, ממיר ה-IP ו-IP 5 6-4 PP-IP ו-IP 7 בהתאמה, ולאחר מכן, באמצעות מוצרים אלה מצעים, לקדם את הדור של מולקולות מורכבות יותר 5,6 . לאחרונה, בשיעור השני של אנזימים pyrophosphate יצירת זוהה בצורה של החלבון שמרים VIP 1 (התייחס גם PP-IP 5 K), אשר מסוגלים להמיר 6 IP ל-IP ו-IP 7 8 7,8.
Pyrophosphates אינוסיטול להסדיר רבים בתהליכים תאיים שונים כגון הפרשת אינסולין 9, אורך הטלומרים 10,11, 12 chemotaxis, סחר שלפוחי 13, הומאוסטזיס פוספט 14 ו-HIV-1 לשחרר איסור פרסום 15. שני המנגנונים של פעולות הוצעו לסוג כזה של מולקולות. הם יכולים להשפיע על התפקוד התאי ידי allosterically אינטראקציה עם חלבונים ספציפיים כמו AKT 16. לחלופין, הקבוצה pyrophosphate יכול לתרום פוספט מראש phosphorylated חלבונים 17. הפוטנציאל העצום של תחום מחקר זה הוא הקשו על ידי בהעדר מקור המסחרי של pyrophosphates אינוסיטול, אשר מונע מדענים רבים ללמוד את המולקולות הללו ואת זה שינוי החדשה שלאחר translational. השיטות הקיימות כיום לבודד pyrophosphates אינוסיטול דורשים מנגנון מתוחכם chromatographic 18,19. נהלים אלה להשתמש תנאים חומציים שעשוי להוביל השפלה pyrophosphate אינוסיטול 20 ובכך התאוששות עניים. יתר על כן, מסורבלת פוסט טור נהלים desalting להגביל את השימוש שלהם במעבדות מיוחדות.
במחקר זה אנו מתארים שיטה תובעני לבידוד, הדור וטיהור של המוצרים של kinase-6 IP ו-IP PP-5-קינאזות תגובות. שיטה זו התאפשרה על ידי היכולת של ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד) כדי לפתור polyphosphates אינוסיטול phosphorylated מאוד 20. לאחר 6 IP K1 ו PP-IP 5 תגובות אנזימטיות באמצעות 6 K-IP כמו המצע, PAGE שימש להפריד את pyrophosphates אינוסיטול שנוצר שהיו eluted לאחר מכן במים.
השימוש pyrophosphate אינוסיטול בביוכימיה מוגבלת בשל זמינותו המסחרי של תרכובות כאלה רגישות העניים של שיטות זיהוי קיימות. השילוב של דף, המאפשר הפרדה של מולקולות בעלי מספר שונה של קבוצות פוספט, וכן Toluidine כחול (איור 1), צבע metachromatic אשר נקשר קבוצות פוספט, מאפשר זיהוי קל של isoforms pyrophoshate אינוסיטול פתיחת אפיקים חדשים של מחקר 20.
השימוש בטכנולוגיה המתוארת PAGE לטהר מוצרים pyrophosphate אינוסיטול התגובה האנזימטית נשאו outby או 6 IP K1 או VIP1 היא שיטה פשוטה, כלכלית אמינה המאפשרת ייצור של כמויות גדולות של ה-IP באיכות גבוהה 7. השיטה שתוארה לעיל אינה מוגבלת טיהור הפשוט של ה-IP 7 אבל שינויים קלים של פרוטוקול המתואר עשוי לאפשר טיהור של מגוון שונה של pyrophosphates אינוסיטול. פוספורילציה גבוהה isoforms pyrophosphate אינוסיטול, המכיל יותר משמונה קבוצות פוספט ניתן לאתר באמצעות IP 7 או כמויות שונות של 6 IP כמו מצע 20,6. Pyrophosphates אינוסיטול אלה ניתן לאתר על ידי הגדלת אורך ההליך מכתים ולאחר מכן מטוהרים (סעיף 3.2). יתר על כן, השימוש 5 IP כמו המצע של התגובה האנזימטית תאפשר טיהור PP-IP ו 5 pyrophosphates אינוסיטול אחרים המכילים קבוצת הידרוקסיל על הטבעת אינוסיטול.
לסיכום, שיטה זו מאפשרת תובעני לטיהור אמין של כמויות מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול עם מכשירים זמינים באופן נרחב, ובכך פותח אפיקים חדשים בתחום מחקר זה מרגש.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים א ריקיו להערות מועיל לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה במימון רפואי (MRC) מחקר ליחידת ביולוגיה של התא ועל ידי האדם Frontier Science Program גרנט (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |