Inositol pyrophosphates spelar en viktig roll i mänskliga sjukdomar såsom cancer, diabetes och fetma, men det är den exakta verkningsmekanismen en tvistefråga. Bristen på kommersiellt tillgängliga inositol pyrophosphates gör detaljerade studier problematiska. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att producera och isolera milligram inositol pyrophosphates.
Myo-inositol är närvarande i naturen antingen oförändrade eller i mer fosforylerade komplexa derivat. Av de senaste, de två mest förekommande i eukaryota celler inositol pentakisphosphate (IP 5) och inositol hexakisphosphate (fytinsyra eller IP 6). IP-5 och IP 6 är föregångare till inositol pyrofosfat molekyler som innehåller en eller flera pyrofosfat obligationer 1. Fosforylering av IP 6 genererar diphoshoinositolpentakisphosphate (IP-7 eller PP-IP 5) och bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP-8 eller (PP) 2-IP 4). Inositol pyrophosphates har isolerats från alla eukaryota organismer hittills studerat. Dessutom är de två olika klasser av enzymer som ansvarar för inositol pyrofosfat syntes mycket bevarad genom evolutionen 2-4.
IP-6-kinaser (IP 6 KS) besitter en enorm katalytisk flexibilitet, konvertera IP 5 och IP 6 till PP-IP 4 och IP respektive 7 och därefter, genom att använda dessa produkter som substrat, främja uppkomsten av mer komplexa molekyler 5,6 . Nyligen var en andra klass av pyrofosfat generera enzymer identifierats i form av jästen protein VIP-1 (även kallat PP-IP 5 K), som kan konvertera IP 6 till IP 7 och IP 8 7,8.
Inositol pyrophosphates reglera många olika cellulära processer såsom insulinutsöndring 9, telomerlängd 10,11, kemotaxi 12, vesikulär människohandel 13, fosfat homeostas 14 och HIV-1 gag släpper 15. Två mekanismer åtgärder har föreslagits för denna klass av molekyler. De kan påverka cellulära funktion genom allosterically interagera med specifika proteiner som AKT 16. Alternativt kan pyrofosfat gruppen donera en fosfat i förväg fosforylerade proteiner 17. Den enorma potential detta forskningsområde är hämmas av avsaknaden av en kommersiell källa inositol pyrophosphates, som hindrar många forskare från att studera dessa molekyler och denna nya post-translationell modifiering. De metoder som för närvarande finns att isolera inositol pyrophosphates kräver avancerade kromatografiska apparater 18,19. Dessa förfaranden använder sura förhållanden som kan leda till inositol pyrofosfat nedbrytning 20 och därmed dålig återhämtning. Dessutom besvärliga efter kolumnen avsaltning förfaranden begränsa deras användning till specialiserade laboratorier.
I denna studie beskriver vi en krävande metod för generering, isolering och rening av produkter för IP 6-kinas och PP-IP 5-kinaser reaktioner. Denna metod var möjligt genom förmåga polyakrylamidgelelektrofores (SIDA) för att lösa mycket fosforyleras inositol polyfosfater 20. Efter IP 6 K1 och PP-IP 5 K enzymatiska reaktioner med hjälp av IP 6 som substrat, var PAGE används för att separera genererade inositol pyrophosphates som därefter elueras i vatten.
Användningen av inositol pyrofosfat i biokemi är starkt begränsad av den kommersiella avsaknad av sådana föreningar och de fattiga känslighet befintliga detektionsmetoder. Kombinationen av SIDA, som möjliggör separation av molekyler som har olika antal fosfatgrupper och toluidinblått (figur 1), en metakromatisk färgämne som binder till fosfatgrupper, möjliggör enkel detektion av inositol pyrophoshate isoformer öppna nya vägar för forskning 20.
Den beskrivna användningen av SIDA-teknik för att rena inositol pyrofosfat produkter av den enzymatiska reaktionen sker outby antingen IP 6 K1 eller VIP1 är en enkel, ekonomisk och tillförlitlig metod som möjliggör för produktion av stora mängder av hög kvalitet IP 7. Metoden som beskrivs ovan är inte begränsat till den enkla rening av IP 7 men mindre ändringar av de beskrivna protokollet kan tillåta rening av olika utbud av inositol pyrophosphates. Högre fosforyleras inositol pyrofosfat isoformer, som innehåller mer än åtta fosfatgrupper kan detekteras med hjälp av IP 7 eller olika mängder av IP 6 som substrat 20,6. Dessa inositol pyrophosphates kan upptäckas genom att öka längden på färgningsproceduren och därefter renas (avsnitt 3.2). Dessutom skulle användningen av IP 5 som substrat för den enzymatiska reaktionen möjliggör rening av PP-IP-5 och andra inositol pyrophosphates som innehåller en hydroxylgrupp på inositol ringen.
Sammanfattningsvis ger detta anspråkslösa metoden för tillförlitlig rening av milligram mängder inositol pyrophosphates med allmänt tillgängliga instrument, vilket öppnar nya vägar för detta spännande forskningsområde.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar A. Riccio för hjälpsamma kommentarer och för att läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av Medical Research Council (MRC) finansiering till Cell Biology Unit och en Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |