क्रायो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एचआईवी -1 capsid विधानसभाओं की संरचना और चलने का पेचदार रियल अंतरिक्ष पुनर्निर्माण

Summary

यह लेख एक helically इकट्ठे क्रायो – इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग अणुओं के एक तीन आयामी संरचना (3 डी) प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल में, हम एचआईवी-1 capsid विधानसभाओं का उपयोग करने के लिए पुनरावृत्त पेचदार वास्तविक अंतरिक्ष पुनर्निर्माण विधि द्वारा एक घनत्व नक्शा प्राप्त करने के लिए विस्तृत 3D पुनर्निर्माण प्रक्रिया को वर्णन.

Abstract

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy¹ and two-dimensional (2D) electron crystallography² have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method³, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments⁴, microtubules⁵, amyloid fibers⁶, tobacco mosaic viruses⁷, and bacteria flagella⁸, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.

In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid⁹ is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

Protocol

1. जमे हुए हाइड्रेटेड EM नमूना तैयारी क्योंकि एचआईवी -1 capsid प्रोटीन (सीए) 9 विधानसभाओं में ही उच्च नमक बफर (1M NaCl) है, जो क्रायो – EM छवियों में मजबूत पृष्ठभूमि शोर का योगदान स्थिर रहे हैं, हम एक तेजी से कमजोर पड़ने और वापस पक्ष सोख्ता विधि का उपयोग transiently नमक कम एकाग्रता जब जमी हाइड्रेटेड EM ग्रिड की तैयारी. ग्लो निर्वहन 25mA के तहत 200 जाल R2 / 1 Quantifoil तांबे ग्रिड के 25 सेकंड के लिए कार्बन की ओर. एक छिटकानेवाला का उपयोग करने के लिए 80% करने के लिए पर्यावरण कक्ष में नमी, एक घर बनाया पुस्तिका गुरुत्वाकर्षण सवार लाने. फी Vitrobot पनडुब्बा Dewar, शांत तरल तरल नाइट्रोजन का उपयोग एटैन. माउंट पुस्तिका गुरुत्वाकर्षण सवार पर उतर – ठंड Dewar. ग्रिड, जो संदंश पर मुहिम शुरू की है की कार्बन पक्ष पर preassembled सीए समाधान के 2.5 μl लागू, और सवार पर तुम से दूर का सामना करना पड़ रहा ग्रिड के कार्बन पक्ष के साथ संदंश लोड. ग्रिड के पीछे की ओर के लिए कम नमक कमजोर पड़ने बफर (100 मिमी NaCl) के 3 μl जोड़ें और तुरंत फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ ग्रिड के पीछे की ओर दाग. ग्रिड के पूरे वापस सतह के निकट संपर्क में लगभग 6 सेकंड के लिए फिल्टर पेपर के साथ फिल्टर पेपर हटाने से पहले किया जाना चाहिए. तुरंत तरल एटैन में फिल्टर पेपर निकालने के बाद ग्रिड डुबकी. सवार से संदंश निकालें और जल्दी से एक ग्रिड भंडारण बॉक्स में ग्रिड को हस्तांतरण. 2. सीए ट्यूबलर विधानसभाओं के क्रायो – इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक फी Polara G2 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग में 200kv पर जमी – हाइड्रेटेड ग्रिड और लोड Gatan 4Kx4K सीसीडी कैमरे के साथ सुसज्जित है. 200x ~ एक magnification से कम खुराक खोज मोड के तहत <0.001e एक खुराक के साथ – / 2 ए, स्क्रीन उपयुक्त बर्फ और एक मंच फ़ाइल में इन क्षेत्रों की स्थिति को बचाने के साथ क्षेत्रों के लिए पूरी ग्रिड. कम खुराक खोज मोड में ३,९०० एक्स एक magnification पर बचाया पदों और आगे स्क्रीन इन क्षेत्रों याद. एक समान, बर्फ की पतली परत के छेद पर अच्छी तरह से अलग, लंबे ट्यूबों, जिसमें डेटा संग्रह के लिए के साथ क्षेत्रों का चयन करें. एक दूसरे चरण फ़ाइल में इन क्षेत्रों के स्थानों को सहेजें. 59,000 एक्स, इनसेट 100 सुक्ष्ममापी उद्देश्य एपर्चर एक magnification पर जोखिम मोड पर स्विच करें, और ~ ई 15 की एक खुराक के लिए उद्देश्य stigmatism और बीम की तीव्रता को समायोजित जोखिम प्रति – / 2 एक. कम खुराक खोज मोड पर लौटें, एक बचाया स्थिति को स्थानांतरित करने के लिए और पहचान और केन्द्र एक अच्छा सीसीडी कैमरे का उपयोग ट्यूब. ध्यान केंद्रित मोड पर स्विच करें, ध्यान समायोजित करने के लिए, और एक defocus मान सेट, सामान्य के बीच 0.5 से 2.5 सुक्ष्ममापी. जोखिम मोड पर स्विच, 0.3-0.5 सेकंड एक जोखिम समय निर्धारित करते हैं, ई 15 की एक खुराक के लिए / 2, और एक छवि इकट्ठा . छवियों को एक थाली कैमरा पर एकत्र होते हैं, और फिल्मों के 10 सेकंड के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए से पहले एक जोखिम लिया है. अगले बचाया स्थिति में ले जाएँ और अधिक छवियों को इकट्ठा करने के लिए चरण 5 दोहराएँ. फिल्मों में पूर्ण शक्ति D19 12 मिनट के लिए विकसित कर रहे हैं और 6.35 सुक्ष्ममापी के एक पिक्सेल आकार में एक Nikon सुपर coolscan 9000 प्रवर्तन निदेशालय स्कैनर का उपयोग कर डिजीटल. छवि फ़ाइलों के प्रारूप झगड़ा है. 3. पेचदार अनुक्रमण एक पेचदार वस्तु दो मापदंडों के द्वारा अनुक्रमित किया जा सकता है: बेसल आदेश, n, और परत लाइन नंबर, एल . फूरियर में प्रत्येक परत लाइन, के रूप में द्वारा विशेषता (n, मैं), पेचदार वस्तु की सतह जाली पर लाइनों का एक सेट करने के लिए संगत से चिह्नित (ज, कश्मीर) सूचकांक, एक 2d जाली से संकेतन का उपयोग कर. किसी भी (घंटे, कश्मीर) के लिए, एक परत (एन एच, एल एच) लाइन के दो बुनियादी (n 10, 10 एल) और वैक्टर (01 n, एल 01), जो के n और मैं मान रहे हैं की एक रैखिक संयोजन है दो प्रमुख परत लाइनों (1, 0) और (0, 1). एल परत लाइन फूरियर परिवरतित Z अक्ष साथ मापा ऊंचाई से प्राप्त किया जा सकता है . n के मूल्य निम्नलिखित 10 समीकरण का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है πRr ≈ जम्मू n 1.1 ≈ | पता | -0.9 एक …………………() जहां जम्मू n Bessel कार्य है, जो n वें परत लाइन की तीव्रता को निर्धारित करता है, अनुसंधान पेचदार वस्तु की त्रिज्या है, और आर परत लाइन की अधिकतम आयाम की त्रिज्या है. परत लाइन नंबर, एल, चयन के नियम 11 द्वारा n करने के लिए संबंधित है एल = तमिलनाडु + उम ………………..( 2) जहां टी और यू हेलिक्स के स्थिरांक हैं. किसी भी हेलिक्स के लिए, वहाँ वास्तव में यू इकाइयों बिल्कुल हो सकता है (या बहुत बारीकी से ) टी गomplete बदल जाता है. वर्दी EMAN कार्यक्रम 12 helixboxer और MRC प्रारूप में छवि को बचाने का उपयोग व्यास के साथ एक अपेक्षाकृत सीधे और लंबी ट्यूब के बाहर बॉक्स. पेचदार दोहराने दूरी, ग, एक पार सहसंबंध आधारित कार्यक्रम का उपयोग, जैसे 'imgccf' MRC 13 पैकेज में निर्धारित करते हैं. एक नया बॉक्स लंबाई है कि दोहराने दूरी, ग का एक अभिन्न फूरियर परिवरतित के साथ गणना. दो प्रमुख परत लाइनों है कि दो बुनियादी सतह जाली वैक्टर परिभाषित (1,0) और (0,1) चुनें. ट्यूब की त्रिज्या, अनुसंधान, और ऊंचाई और फूरियर परिवरतित, एल 10, 10 आर एल 01 01 आर, क्रमशः (1 छवि) में दो प्रमुख परत लाइनों की त्रिज्या उपाय. 10 n और समीकरण (1) के अनुसार 01 n की गणना. चूंकि पता मूल्यों केवल अनुमान हैं, 10 n और n 01 के कुछ संयोजन के बाद के चरणों में परीक्षण कर रहे हैं (4.2 कदम देखें) सही पेचदार कार्यक्रम पैकेज IHRSR का उपयोग समरूपता मिल. सब यूनिटों (Δφ) और एक सितारा हेलिक्स के axial वृद्धि (Δz) (n = 1) के बीच रोटेशन: पेंच दो वास्तविक संख्या द्वारा वर्णित समरूपता की गणना . 10 एल, एल 01, 10 n और n 01 मूल्यों को देखते हुए, यू और टी मीटर मूल्यों की एक सीमा (उदाहरण के लिए, -50 <<मीटर 50) चयन नियम के अनुसार परीक्षण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है है अंत में, Δφ और Δz का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं Δφ = 360 टी / यू और Δz = c / u. 4. तीन आयामी पुनर्निर्माण कण विभाजन एक पेचदार कणों से युक्त माइक्रोग्राफ खोलें, ग्राफिकल कार्यक्रम बॉक्सर, जो EMAN पैकेज में एक कार्यक्रम है का उपयोग. अतिव्यापी क्षेत्रों में पेचदार कण कट. बॉक्सर के नियंत्रण कक्ष में, हेलिक्स मोड का चयन और मुक्केबाजी के लिए पैरामीटर सेट: बॉक्स के आकार के कण का व्यास और OLAP ~ बॉक्स आकार के 90% होना चाहिए के लिए मूल्य की तुलना में बड़ा होना चाहिए. पेचदार कण के दोनों छोर पर छोड़ दिया क्लिक करने के बाद, बॉक्सर हेलिक्स लंबाई के साथ स्वत: कण बक्से की एक श्रृंखला उत्पन्न होगा. बॉक्सिंग क्षेत्रों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने निर्देशांक सहेजें. प्रारंभिक 3D IHRSR कार्यक्रमों का उपयोग पुनर्निर्माण उलटें क्रायो – EM छवियों के विपरीत और कम से गुजारें 14 (वैकल्पिक) पहले पुनरावृत्त पेचदार असली अंतरिक्ष पुनर्निर्माण विधि (IHRSR) के साथ प्रसंस्करण के लिए फ़िल्टरिंग लागू . "जनरेटर" टाइपिंग द्वारा IHRSR कार्यक्रम का आलेखीय अंतरफलक खोलें. बॉक्सिंग कणों के ढेर के लिए सभी जानकारी नाम और ढेर के पथ ढेर में छवियों की संख्या सहित, के साथ सुचित्रित इंटरफेस प्रदान करते हैं, समरूपता पैरामीटर के लिए मान, आदि "समाप्त" बटन क्लिक करें पुनर्निर्माण स्क्रिप्ट बनाने, b25.spi. एक प्रारंभिक संदर्भ के रूप में एक ठोस या खोखले सिलेंडर का प्रयोग करें और चक्र के लिए प्रक्रिया की अनुमति जब तक वहाँ परिभाषित पेंच समरूपता में कोई परिवर्तन, जो आम तौर पर कुछ चक्रों के बाद होता है. एक सही पेचदार समरूपता एक stably जुटे पुनर्निर्माण देना चाहिए. पिछले चक्र में उत्पन्न पुनर्निर्माण आगे शोधन के लिए एक प्रारंभिक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. IHRSR 3D पुनर्निर्माण स्पाइडर कार्यक्रमों का उपयोग करता है. पुनरावृत्त 15 शोधन के साथ पुनर्निर्माण 3D पुनर्निर्माण IHRSR द्वारा उत्पन्न अब अतिरिक्त शोधन के लिए एक प्रारंभिक संदर्भ के रूप में प्रयोग किया जाता है . शोधन के दौरान, पेचदार समरूपता Δφ और Δz, जो IHRSR प्रक्रिया से निर्धारित कर रहे हैं पर तय हो गई है. Defocus और कार्यक्रमों CTFFIND3 और CTFTILT 16 का उपयोग माइक्रोग्राफ में दृष्टिवैषम्य वर्तमान का निर्धारण करते हैं . मकड़ी कार्यक्रमों 17 का उपयोग CTF द्वारा कण क्षेत्रों गुणा. मकड़ी कमरे में एफटी करार दिया आपरेशन करने के लिए 2 डी छवि के फूरियर परिवरतित (FFT) की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके बाद, FFT CTF मूल्यों से गुणा किया जाता है, पिछले चरणों में निर्धारित, आपरेशन का उपयोग मकड़ी सूट के भीतर म्यू करार दिया. प्राप्त मान फिर व्युत्क्रम वापस असली अंतरिक्ष में एक नया (CTF सही) छवि मकड़ी आपरेशन का उपयोग के रूप में तब्दील करने के लिए, एफटी फिर है. CTF सही छवियों के साथ संदर्भ संस्करणों के अनुमानों की तुलना, बहु संदर्भ संरेखण का उपयोग करके प्रक्षेपण मिलान निष्पादित करें. बाहर के विमान झुकाव कोण में भिन्नता लिए + / -10 के लिए सीमित है ° और 1 ° चरणों में नमूना. उच्च सहसंबंध गुणांक जैसे बाधाओं, में विमान 0 ° या 180 °, और सीमित एक्स – पाली के पास कोण प्रत्येक खंड के संरेखण मापदंडों के लिए परिचय. पुनर्निर्माण केवल उन क्षेत्रों है कि बाधाओं को संतुष्ट में शामिल करें. के बाद प्रत्येक शोधन चक्र चलने का, एक 3 डी पुनर्निर्माण वापस प्रक्षेपण का उपयोग कर उत्पन्न होता है और विभाजित CTF अधिक राशि द्वारा2. पेचदार समरूपता लागू करने के लिए एक symmetrized मात्रा उत्पन्न. शोधन पुनरावृत्त जब नए 3D पुनर्निर्माण के संकल्प में आगे कोई सुधार होता है समाप्त होता है. छवि प्रसंस्करण पैकेज स्पाइडर शोधन कदम के अधिकांश के लिए प्रयोग किया जाता है. आपरेशनों की एक श्रृंखला मकड़ी स्क्रिप्ट है, जो उपयोगकर्ता बनाया बैच नियंत्रण संचालन और पैरामीटर मान के दृश्यों से युक्त फ़ाइलों द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. अंतिम पुनर्निर्माण मकड़ी सुइट में कार्यक्रमों का उपयोग कर की गणना है. 5. प्रतिनिधि परिणाम: एक एकल एचआईवी -1 सीए A92E ट्यूब (छवि 1a) बॉक्सिंग बाहर किया गया था और उसके फूरियर परिवरतित (छवि 1b) पेचदार अनुक्रमण के लिए गणना की थी. परत लाइनों (1, 0) और (0, 1) के लिए, एल 10 = 28, एल 01 = 37, 10 आर = 55, आर 01 = 44. 211.57Å की एक ट्यूब त्रिज्या को देखते हुए, हम approximated n =- 10, 12, n 01 = 11 (यहाँ, मनमानी पूर्व निर्धारित किया गया था). = 6.8093Å 5195.48Å के एक दोहराने की दूरी के साथ, ट्यूब के पेंच समरूपता Δz के रूप में निर्धारित किया गया था, Δφ 328.88 = °. Δz और Δφ 7.1321Å और 328.86 के लिए परिष्कृत थे ° IHRSR (छवि 2a) और प्रारंभिक पुनर्निर्माण छवि में दिखाया गया है का उपयोग कर. 2b. अंतिम पुनर्निर्माण (3 छवि), शोधन पुनरावृत्त के बाद, घनत्व नक्शा काफी सुधार प्रारंभिक IHRSR (छवि 2b) के साथ गणना मॉडल से. चित्रा 1 एचआईवी -1 सीए पेचदार ट्यूब अनुक्रमणिका. (ए) एक एकल एचआईवी -1 CA A92E ट्यूब छवि. स्केल बार, 30 एनएम. (बी) फूरियर ट्यूब के (ए) में दिखाया गया है बदलना. पेचदार सूचकांक (n =- 10, 12, n 01 = 11) चिह्नित हैं . 23A संकल्प पर परत लाइन arrowhead अंक. चित्रा 2 एक प्रारंभिक IHRSR का उपयोग पुनर्निर्माण. (ए) प्रत्येक चक्र पुनरावृत्त के लिए भाड़ में समरूपता दृढ़ संकल्प. Δφ और Δz, प्रारंभिक मान से शुरू, स्थिर मूल्यों को एकाग्र बाद 10 शोधन चक्र चलने का. (बी) के प्रारंभिक 10 के बाद 3 डी घनत्व नक्शा चक्र चलने का. चित्रा 3. 3D शोधन पुनरावृत्त के बाद घनत्व नक्शे. (एसी) सीए के घनत्व नक्शा ट्यूबों तीन orthogonal स्लाइस के रूप में प्रदर्शित होता है: ट्यूब धुरी के समानांतर और सतह (ए) के करीब है, ट्यूब अक्ष (बी) के लिए सीधा है, और समानांतर करने के लिए और के माध्यम से ट्यूब अक्ष (सी) . स्केल सलाखों, 10 एनएम. (डी) 3 डी घनत्व नक्शे के भूतल प्रतिपादन 1.8s पर contoured 100% मात्रा enclosing.

Discussion

हम के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए पेचदार वस्तुओं के 3D संरचनाओं प्राप्त प्रोटोकॉल का एक सेट प्रस्तुत करते हैं. वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम एक एकल ट्यूब छवि (176 खंडों) से एचआईवी 1 capsid विधानसभा के एक 3D संरचना का अधिग्रहण किया. उच्च संकल्प संरचनाओं और छवि डेटा को शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है.

वहाँ इष्टतम डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदुओं हैं: पहले एक क्रायो – EM नमूना की तैयारी के दौरान, नमूना समाधान दूर blotted किया जाना चाहिए, एक समान, समाधान की पतली परत है कि नमूने का आकार की तुलना में थोड़ा मोटा है छोड़ने. नमूना दाग वहाँ कई अलग अलग तरीके हैं. बैक्टीरियल कोशिकाओं और एचआईवी-1 सीए विधानसभा जैसे ट्यूबलर नमूनों, एक तरफ से वापस की ओर से विशेष रूप से, सोख्ता के लिए सबसे उपयुक्त है.

दूसरा, हेलिक्स की मनमानी के लिए निर्धारित किया जाता है, के रूप में इस पेचदार अनुक्रमण या पुनर्निर्माण के द्वारा नहीं किया जा सकता की जरूरत है. एक आम अभ्यास करने के लिए फ्रीज नक़्क़ाशी, रोटरी ¹⁸ ग्रहण मनमानी निर्धारित द्वारा पीछा का उपयोग करने के लिए है. मनमानी के पुनर्निर्माण के बाद भी निर्धारित किया जा सकता है जब घनत्व नक्शे के पर्याप्त उच्च संकल्प है, व्यक्तिगत घटकों के 3D परमाणु मॉडल को अच्छी तरह से घनत्व नक्शे में फिट है जब एक सही मनमानी मान लिया जाता है. अन्यथा, विपरीत मनमानी ग्रहण किया जाना चाहिए.

तीसरा, एक वीनर फिल्टर छवि प्रसंस्करण के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए, दोनों चरण और आयाम के सुधार के लिए, शोर प्रवर्धन को कम. चूंकि एक एकल छवि से CTF हमेशा शून्य क्रॉसिंग, पारस्परिक अंतरिक्ष में जानकारी का हिस्सा खो दिया है. इसलिए, यह आवश्यक है एकाधिक प्रक्षेपण डेटा 3D पुनर्निर्माण, प्रत्येक imaged के लिए विभिन्न defocus मूल्यों पर शामिल सेट.

Materials

Name	Source	Comments
Glow-discharge device 100X	Glow-discharge device 100X
Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR
Gatan 4K x 4K CCD camera	Gatan, Pleasanton, CA
Plunge-freezing device		Home-made manual gravity plunger
Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany
EM software EMAN	http://blake.bcm.edu/EMAN/
EM software IHRSR	http://people.virginia.edu/~ehe2n/	Programs available from Edward H. Egelman
EM software Spider	http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
MRC based helical processing software	http://www.riken.jp/biostrmech/index.html	Programs available from Koji Yonekura
CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software	http://emlab.rose2.brandeis.edu/software