Transplante precursoras neurais é uma estratégia promissora para a proteção e / ou substituição perdido / cervical disfuncional neurônios motores frênicos em lesão medular (SCI) e do neurônio motor doença, a esclerose amiotrófica laterais (ALS). Nós fornecemos um protocolo para entrega celular para chifre da medula espinhal cervical ventral em modelos de roedores da ALS e SCI.
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Artigo de método
Intra Transplante de Células de Segmentação Chifre Cervical Ventral em Esclerose Lateral Amiotrófica e lesão medular traumática
Neste artigo
Resumo
Resumo
Comprometimento respiratório devido à perda de neurônio motor frênico é uma conseqüência debilitantes de uma grande proporção de lesão da medula espinhal humana traumático (SCI) casos 1 e é a causa final da morte em pacientes com a doença do neurônio motor, esclerose amiotrófica laterais (ALS) 2.
ALS é uma doença devastadora neurológico que se caracteriza pela degeneração relativamente rápida de letras maiúsculas e neurônios motores inferiores. Pacientes finalmente sucumbir à doença, em média, 2-5 anos após o diagnóstico devido à paralisia respiratória devido à perda de innnervation frênico do neurônio motor do diafragma 3. A grande maioria dos casos são esporádicos, enquanto 10% são da forma familiar. Cerca de vinte por cento de casos familiares estão ligados a várias mutações pontuais no gene Cu / Zn superóxido dismutase 1 (SOD1) no cromossomo 21 4. Camundongos transgênicos e ratos 4,5 6 carregando humana mutante SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) foram gerados, e, apesar da existência de outros modelos animais de perda de neurônios motores, são atualmente os modelos mais altamente utilizado da doença .
Lesão da medula espinal (SCI) é um conjunto heterogêneo de condições resultantes de trauma físico para a medula espinhal, com resultado funcional variando de acordo com o tipo, localização e gravidade da lesão 7. No entanto, aproximadamente metade dos casos humanos SCI afetar regiões cervical, resultando em disfunção respiratória debilitante devido à perda frênico neurônio motor e ferimentos descendente axônios respiratórias bulbo-espinal 1. Uma série de modelos animais de SCI têm sido desenvolvidas, com os mais comumente utilizados e clinicamente relevante é a contusão 8.
Transplante de várias classes de células precursoras neurais (NPCs) é uma promissora estratégia terapêutica para o tratamento de lesões traumáticas do SNC e neurodegeneração, incluindo ALS e SCI, por causa da capacidade de substituir neuroproteção perdido ou disfuncional tipos de células do SNC, fornecer, entregar e fatores genéticos de interesse 9.
Modelos animais de ambos os ALS e SCI pode modelar muitos aspectos clinicamente relevantes dessas doenças, incluindo a perda do neurônio motor frênico e conseqüente comprometimento respiratório 10,11. , A fim de avaliar a eficácia da NPC estratégias baseadas na função respiratória nestes modelos animais de ALS e SCI, as intervenções de celulares deve ser especificamente direcionada para regiões que contêm alvos terapêuticos relevantes, tais como os neurônios motores frênico. Nós fornecemos um protocolo detalhado para multi-segmentar transplante, intraspinal de NPCs para o assunto da coluna cervical ventral cabo cinza de modelos neurodegenerativas, como ratos SOD1 G93A e ratos, assim como os ratos com lesão medular e camundongos 11.
Protocolo
Métodos
1. Preparação de células
Como exemplo, vamos descrever o procedimento para a preparação de células progenitoras gliais 12 para transplante por causa da nossa experiência com este tipo de célula. No entanto, as especificidades do protocolo, incluindo médio e uso de tripsina, por exemplo, vai depender do tipo particular de célula a ser utilizado para transplante.
- Pré-aquecer todas as soluções para 37,0 ° C em banho-maria.
- Enxágüe 2X frasco com HBSS. Adicionar 5,0 mL/T-75 frasco de 0,05% Tripsina / EDTA. Incubar frasco por 3 minutos em 37,0 ° C incubadora. Triturar 3X delicada....
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Discussão
Para estudos envolvendo ratos SOD1 G93A e ratos, idade e sexo-match os animais dentro de um grupo, e distribuir os animais dentro da mesma ninhada a diferentes grupos. É preferível usar todos os animais do mesmo sexo para ambos ALS e modelos SCI porque os processos de doença pode ser diferente entre machos e fêmeas, no entanto, também pode ser útil ter animais de ambos os sexos suficiente para detectar possíveis efeitos específicos de sexo, como este fenômeno tem sido relatada com SOD1 G93A 13 e ra.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaria de agradecer: todos os membros da Lepore, Maragakis e Rothstein laboratórios para discussão útil; Os Veteranos Paralisados da América e do Craig H. Neilsen Fundação para o financiamento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| HBSS | Gibco | 14170 | |
| Tripsina 0,05% | Gibco | 25300 | |
| Inibidor de tripsina de soja (opcional) | Sigma | T-6522 | |
| Acepromazina maleato (0,7 mg / kg) | Fermentação da Saúde Animal | ||
| Ketamina (95 mg / kg) | Fort Dodge Saúde Animal | ||
| Xilazina (10 mg / kg) | Bayer | ||
| # Feather lâmina cirúrgica 11 | Microscopia Eletrônica de Ciências | 72044-11 | |
| Aplicadores com ponta de algodão (6 polegadas) | Pescador | 23-400-101 | |
| Rat-toothed forceps | Multa Ferramentas Ciência | Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 | |
| Médias empresas tesoura primavera | Multa Ferramentas Ciência | 15012-12 | |
| Mini mola tesoura | Multa Ferramentas Ciência | 15000-10 | |
| Rongeur | Multa Ferramentas Ciência | Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 | |
| Microknife | Multa Ferramentas Ciência | 10056-12 | |
| Porta-agulhas | Multa Ferramentas Ciência | 12502-14 | |
| Sutura: 4-0 | Vicryl | S-183 | |
| Staples: 9 mm | Autoclip | 427631 | |
| Grampeador: 9 mm (Reflex # 203-1000) | Precision Instruments mundo | 5000344 | |
| Bomba de água quente (T Bomba /) | Gaymar | P / N 07999-000 | |
| Ciclosporina A: 250,0 mg/5.0 mL ampolas | Novartis / Sandimmune | NDC 0078-0109-01 | |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 | |
| Rapamicina | LC Laboratories | R-5000 | |
| Injetor | Precision Instruments mundo | UMP2 | |
| 4 Micro Controlador de Bombas Microsseringa | Precision Instruments mundo | UMC4 | |
| Micromanipulador | Precision Instruments mundo | Kite-R | |
| 10,0 mL seringa Hamilton | Hamilton | 80030 | |
| Agulhas Hamilton: 33 gauge, 45 de bisel °, 1 polegada | Hamilton | 7803-05 | |
| 20,0 mL de vidro pipetas microcapilar (opcional) | Kimble | 71900-20 |
Referências
- Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Chest. Med. 15, 675-675....
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Reimpressões e permissões
