Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage
Summary
Uma variedade de fatores de crescimento e proteínas interagem para induzir as células a assumir os destinos diferentes de células durante o desenvolvimento. Aqui mostramos o uso de um ovo na preparação para enfrentar as possíveis interações entre diferentes proteínas no desenvolvimento, colocando contas em e2.5 embriões de galinha.
Abstract
O tubo neural expressa em muitas proteínas específicas padrões espaço-temporais durante o desenvolvimento. Essas proteínas foram mostrados para ser crítico para a determinação de célula destino, migração celular e formação de circuitos neurais. Indução neuronal e padronização envolvem proteína morfogenética óssea (BMP), sonic hedgehog (SHH), fator de crescimento fibroblástico (FGF), entre outros. Em particular, o padrão de expressão de Fgf8 está em estreita proximidade com regiões expressar BMP4 e SHH. Este padrão de expressão é consistente com interações de desenvolvimento que facilitam a padronização no telencéfalo.
Aqui nós fornecemos uma demonstração visual de um método em que um ovo em preparação pode ser usado para testar os efeitos de fgfs na formação do cérebro anterior. Grânulos são revestidos com proteína e colocado no tubo neural em desenvolvimento para oferecer a exposição sustentado. Porque o procedimento utiliza pequenas, miçangas cuidadosamente colocados, é minimamente invasivo e permite várias contas para ser colocado dentro de um único tubo neural. Além disso, o método permite o desenvolvimento contínuo de modo que os embriões podem ser analisados em um estágio mais maduro para detectar alterações na anatomia e na padronização neural. Este protocolo simples, mas útil permite a visualização em tempo real. Ele fornece um meio de fazer mudanças espacialmente e temporalmente limitado a níveis de proteína endógena.
Protocol
Discussion
Dependendo da proteína que você deseja utilizar, existem diferentes protocolos sobre como preparar as contas. Nesses experimentos, usamos heparina em acrílico contas, mas Affi-gel contas também pode ser usado. Descobrimos que as contas heparina em acrílico são mais fáceis de manipular no ambiente aquoso do ovo albumina. Grânulos são embebidos em 5 l de proteína durante a noite a 4 ° C. Esferas de controlo são colocados em PBS estéril até o momento da colocação. A vantagem de usar um ovo na preparação é que o embrião aind…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
Referências
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neurociência. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
