Нормальный взрослый васкуляризированной ткани млекопитающих, что не хватает физиологических ангиогенеза и который не подвергался хирургическому вмешательству используется для изучения: (я) возникновение и развитие ангиогенеза после внутрибрюшинного введения тестовых агентов, и (II) изменение ангиогенеза следующие системные администрации выбранного теста агентов.
The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; (iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).
Анализ был введен в 1986 году и имеет 3 последовательно получили дальнейшее развитие и уточнение в нашей лаборатории 7,10-12. Как отмечалось в обзорных статьях (приглашен) 1, 2, анализа сравнивает хорошо с других млекопитающих в естественных условиях анализа ангиогенеза в отношении особенно важны такие функции, как взрослые ткани тест изначально васкуляризированной и недостатки физиологического ангиогенеза; минимальные травмы, если таковые имеются, нанесенных ткани; действительно количественные переменные измерены, которая позволяет звуковой статистический анализ по доза-реакция и молекулярно-активность исследований; прорастания кровеносных сосудов происходит, который преобладает в нормальных тканях и опухолей, а также данных о токсичности легко накапливаются в крысах, которые растут энергично физиологически во взрослом возрасте. Невыгодные особенности могут включать то, что анализ является сравнительно много времени, особенно при оценке количества и длины отдельных сегментов капилляров и микрососудов ростки, что оно не позволяет real-time/serial наблюдений, и что она вряд ли подойдет для мышей так как многие брыжеечной окнами у мышей отсутствие потенциальных микрососудов родителей, из которых новые капилляры могут возникать.
В режиме реального времени наблюдения, однако, включены по прижизненной микроскопии, где экстериоризируется но нетронутыми брыжеечной окна растопыренными над столике микроскопа в то время как животное под наркозом, как описано в 1.
Значительные достижения в области ангиогенеза исследования были достигнуты в последние десятилетия с использованием моделей, таких как роговицы micropocket, цыпленок chorioallantoic мембраны, и подкожно анализов Матригель вилки, которые являются полезными, но в конечном счете, ограниченные средства. Будущее клинического применения антиангиогенного и проангиогенных терапии необходимость создания и проверки более чувствительным и биологически значимым, по-настоящему количественные доклинических моделях, например, описанный в настоящем докладе.
The authors have nothing to disclose.
Финансовую поддержку для большинства исследований были предоставлены шведским Советом по медицинским исследованиям (грант 5942).
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)