Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Summary

Biz bir kolajen bazlı geliştirdik<em> In vitro</em> Tüm meme kanseri alt tiplerinin örnekleri çoğalması ve işgali teşvik tahlil. Optik Projektör Tomografi, üç boyutlu mikroskopi tekniği tümör genişlemesi görselleştirmek ve ölçmek için kullanılmıştır. Bu testte, bireysel tümör örneklerinin ilaç tepkisini ölçmek için kullanılıyor olabilir.

Abstract

Meme kanseri, Batı dünyasının önde gelen ölüm nedenidir. Bu, ilk önce meme kanserinin yayılmasını yerel ve daha sonra distalde, hasta prognozu önemli bir faktör olduğunu kurulmuştur. Deneysel meme kanseri sistemleri, genellikle birincil tümörler veya plevral efüzyon türetilen hücre hatları güveniyor. Iki büyük engel bu araştırma engel: (i) bazı bilinen meme kanseri (özellikle kötü prognoz luminal B tümörler) alt türleri mevcut hat koleksiyonları içinde temsil edilmemektedir, (ii), tümör mikroçevresinin etkisi genellikle dikkate alınmaz.

Biz tüm alt türleri kültür primer meme kanseri örneklerinde bir teknik göstermektedir. Bu tümör küçük parçalar Ben yastıklar, yumuşak sıçan kollajen gömülü olduğu üç boyutlu (3D) kültür sistemi kullanılarak elde edilir. 2-3 hafta içinde, tümör hücreleri, kollajen yayılmış ve insan tumours1 görülenlere benzer çeşitli yapılar oluşturur. Canlı adipositler, orijinal çekirdek içinde epitel hücreleri ve fibroblastlar histoloji belirgindi. Squamoid morfolojisi malign epitel hücreleri çevreleyen kolajen içine işgalci gösterildi. Nükleer pleomorfizm, mitotik figürler ve apoptotik organları ile birlikte, bu hücrelerin içinde açıkça görülmüştür.

Biz kültür tümörün yayılma derecesi ölçmek için Optik Projeksiyon Tomografi (OPT), 3D görüntüleme teknolojisine, istihdam var. Biz, tümör kültür toplu hacmini ölçmek için OPT, bir parametre, ilaç tedavisine yanıtı değerlendirmek için rutin meme kanseri hastalarının, neo-adjuvan tedavi sırasında ölçülen.

Burada alt türü önyargısız kültür insan göğüs tümörleri bir fırsat ve bu ex vivo yayılmasını ölçmek. Bu yöntem gelecekte orijinal tümör ilaç duyarlılığını ölçmek için kullanılan olabilir. Bu, şu anda kullanılan hücre hatları daha prediktif model sağlayabilir.

Protocol

1. Rat Tails Kollajen ayıklanıyor % 70 etanol içinde dondurulmuş taze sıçan kuyrukları yerleştirin. Bir neşter açığa tendonlar ile örten cilt Deglove. Tendon kuyruk ve sterilize etmek için% 70 etanol yer uzak soyun. Toplanan tendon ve asetik asit (250ml 0,5 M asetik asit 1g tendon) transfer tartılır. 4 48hr karıştırın ° C. 30 dakika 10.000 g / tendon asetik asit karışımı Santrifüj ve pelet atın. Süpernatantı eşit miktarda% 10 (w / v) NaCl ekleyin ve karışımı 4 gecede bekletilmesi ° C. G. 10.000 ilave bir 30 dakika için kollajen zengin, çözünmez alt katman ve centrifugate toplayın Süspanse edin 4 0.25m asetik asit kollajen zengin malzeme ° C ve 4 ° C'de 3 gün boyunca, günde iki kez diyaliz tampon değişen 1:1000 asetik asit karşı diyaliz. Ayrıca 4 santrifüj (20.000 g 2saat için) ve mağaza kollajen çözümü sterilize ° C. 1mg/ml bir stok konsantrasyonu steril 1:1000 asetik asit ilavesi ile gerektiği gibi kolajen sulandırınız. 2. 3D Testi Oluşturma 3D testi bir hücre hattı assay dayalı, daha önce 2 yayınladı. Çoklu çekirdek biyopsisi, invaziv meme kanseri için küratif cerrahi rezeksiyon zaman olan hastalarda rıza hasat edilir. Göz, 1mm 3 parça halinde bir neşter kullanılarak çekirdek bölün. Düzeltin ve makroskopik farklı yağ atın. MEGM Komple medya parçaları bırakın. Bu durumda doku kadar 1hr saklanabilir. Buz 1mg/ml sıçan kuyruğu kollajen kollajen jel, mix oluşturmak için, 1:1000 filtreli asetik asit, 10x DMEM/F12 3:5:1:1 bir oran ve 0.22M NaOH 0.3 nihai kollajen konsantrasyonunu oluşturmak için mg / ml. 37 ° 1.2ml, kollajen karışımı bir inkübatör içine 24 plaka yeri ve bireysel kuyulara enjekte ° C'de 10 dakika süreyle jelleşme başlatmak için. 10dk sonra kuvöz, 24 plaka kaldırın. Jelleşme kollajen tümör parçaları yerleştirin ve yavaşça 10μl bir pipet kullanarak jel merkezine onları itmek. 24 plaka 1hr inkübatör dönün. ER + tümörleri için, 3.2×10 -10 M. bir konsantrasyon ile β-estradiol MEGM Komple medya ek Jel deneyleri 1hr jel sonra, her bir kuyunun içine dikkatlice takviye medya 1.2ml tanıtmak. Tahlil içinde son β-östradiol konsantrasyonu 3 meme dokusunun fizyolojik östrojen düzeylerini özetlemek 1.6×10 -10 M equilibriate. Böylece medyanın her jel içinde serbestçe yüzen dairesel sağlayan her jel bırakmadan, her bir kuyunun iç kenarı etrafında bir 10μl pipet, çalıştırın. Kuvöz, 24 plaka dönün. Exchange medya deney sona kadar haftada iki kez desteklenmelidir. Medya çıkarılması ve formalin fiksatif ekleyerek deney sonlandırın. 3. Optik Projeksiyon Tomografi için hazırlık Testi Antikor Boyama Biz tüm numune boyama 4 için daha önce yayınlanmış bir yöntem benimsedik . Formalin sabit örnekleri PBS içinde 30 dakika yıkayın. :% 0.05 Tween 20 (% 0.05 PBST) içeren PBS her aşamasında% 33,% 66 ve% 100 ≥ 15dk seyreltilmiş metanol kademeli jeller dehydrate. DMSO::% 30 H 2 O otofloresans gidermek için oda sıcaklığında 24 saat için 2:01:03 'lik bir oran (% 15 v / v H 2 O 2) 2 taze hazırlanmış MeOH doku inkübe edin. Örnekleri metanol içerisinde 30 dakika için iki kez yıkayın. Numuneler -80 ° C oda sıcaklığında (RT) en azından geri 1hr her zaman ve doku derin kısımlarında bu antijenleri sağlamak için beş kez işlenir erişilebilir dondurun. Seyreltici (her adımda% 33,% 66 ve 15 dakika için% 100) olarak metanol ile geri% 0.05 PBST doku rehidrate. 24 saat için çözüm engelleme (% 0,05 PBST serum% 10) doku engelleyin. 48hr için% 5 DMSO içeren engelleme çözüm 1.5ml içinde seyreltilmiş 1:500 konsantrasyonda anti-sitokeratin tavşan kullanarak, epitel içeriğini belirlemek için doku primer antikor ile inkübe edin. 30 dakika her biri için% 0.05 PBST örnekleri dört kez yıkayın. 48hr için% 5 DMSO içeren 1.5ml engelleme çözüm seyreltilmiş ikincil floresan antikor (1:100 keçi anti-tavşan Alexa555), doku inkübe edin. Örnekleri 30 dakika her biri için% 0.05 PBST dört kez tekrar yıkayın. 4. Optik Projeksiyon Tomografi Optik projeksiyon tomografi, 15 milimetre 5 kalınlığında floresan biyolojik örneklerin yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntüler üretmek için önceden geliştirilmiş bir mikroskopi tekniği. Mount ssaklanmaktadır% 1 düşük erime noktası agaroz jel ve 24 saat için% 100 metanol kurutmak. Babb çözümü (1:2 Benzil alkol, Benzil benzoat) 48hr için örnek temizleyin ve OPT 3001M Tarayıcı (Bioptonics) kullanarak tarama. Hem hedef ve otofloresans Cy3 filtre seti (uyarıcı 545nm/30 nm, yayıcı 610 / 75 nm) ve sırasıyla GFP1 filtre seti (uyarıcı 425nm/40 nm, yayıcı LP475 nm) kullanarak yakalanır. 5. İmar ve 3D kantifikasyon OPT tarafından satın açısal projeksiyonlar kesit dilimleri işgali tahlil aracılığıyla bir dizi oluşturmak için NRecon yazılımı (SkyScan) kullanarak yeniden olabilir. Bu yazılımı ücretsiz olarak indirmek için kullanılabilir. http://www.skyscan.be/products/downloads.htm . Volocity yazılım (Perkin Elmer) kullanarak yeniden inşa verileri analiz edin. Gösteri Ücretsiz yazılımı indirmek için kullanılabilir. http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ . Sitokeratin boyanarak epitel hacmi ölçmek için, hedef kanal eşiğe girişimi azaltmak için en az voksel yoğunluğu eşik ayarlayın. Biz mevcut parametrelerin ölçümü uygulaması listesini kullanarak 9000 au ampirik bu eşiğin tanımlanan orijinal çekirdek (autofluorescent kanal demarcated) süreklilik epitel hacmi sayısal Bu bize farklı arasındaki epitel akıbet hacimleri ölçmek için izin tümör örneği. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Testin geliştirilmesi sırasında, toplam 52 meme kanseri biyopsi örneklerinde histopatoloji geniş bir yelpazesi ile kullanılmaktadır. Bunlardan <% 10 (5 / 52) en az bir canlı işgali tahlil sağlamak için başarısız oldu. Testi yetmezliği, bakteriyel enfeksiyon ya da üstü ya da yetersiz tümör biyopsisinin malzeme nedeniyle oldu. Bu nedenle testin uygulanması, meme kanserinin belirli bir alt tipi ile sınırlı değildir. Tipik testleri (Şekil 1), 20 gün sonra kolajen kültür sabit ve sonradan sitokeratin boyandı. Volocity yazılım orijinal çekirdek ve müstakil hücreleri istila grupları ile sürekli epitel toplu hem de tanımak ve her birimin ayrı ayrı ölçmek için yapabiliyor. Fiksasyon ve miktar aşağıdaki Şekil 1 Invasion testleri. Birden fazla meme kanseri alt tiplerinin elde edilen numunelerin tahlil destekler: a) ER + b) HER2 + ve c) ER-.

Discussion

Kanser hücre hatları davranışlarını incelemek için kolajen bazlı testlerin artık yaygın ^olarak 6,7,8 kullanılır . Bununla birlikte, bu testlerin, tümör ve çevresinin tam karmaşıklığı yansıtılmaz. Bu çalışmada, insan meme kanseri malzemeleri, benzer bir biçimde, ex vivo kullanılabilir . Ayrıca, OPT, meme kanseri 3D genişleme karakterize etmek için yararlı bir araçtır. Biz bu tekniğin ana sınırlama tümör malzemeleri (tek bir biyopsi 4-6 deneyleri için yeterli) olduğu bulundu. Başka bir sınırlayıcı faktör yapısal işgali, sadece testlerin yaklaşık% 40 oluşur. Bunu aşmak için, düzenli olarak görünür büyüme ile 7 gün etrafında istenen herhangi bir tedavi tüm analizler eklemek.

OPT kullanımı da toplu değişiklik, ex vivo, ilaç tedavisinden kaynaklanan algılamak için gelecekte uzatılabilir. Bu da daha bireyselleştirilmiş kanser tedavisi, hayvan modellerinde bağımsız kolaylaştırabilir. Şu anda ER + tümörler tamoksifen ex vivo yanıt keşfediyoruz.

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue No.
MEGM Complete	Lonza	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-oestradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Rabbit anti-cytokeratin	Dako	Z0622
Goat anti-rabbit Alexa555	Invitrogen	A21422

All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich.