L'utilisation d'un piège optique pour l'étude des interactions hôtes pathogènes pour l'imagerie cellulaire dynamique en direct
Summary
Une méthode est décrite de sélectionner individuellement, manipuler, et les agents pathogènes d'image en direct en utilisant un piège optique couplé à un microscope à disque rotatif. Le piège optique offre un contrôle spatial et temporel des organismes et les places adjacentes aux cellules hôtes. La microscopie à fluorescence capture dynamique des interactions intercellulaires avec perturbation minimale pour les cellules.
Abstract
Dynamique imagerie des cellules vivantes permet la visualisation directe des interactions en temps réel entre les cellules du système immunitaire 1, 2, cependant, le manque de contrôle spatial et temporel entre les cellules phagocytaires et de microbe a rendu concentré observations sur les interactions initiale de réponse de l'hôte aux pathogènes difficiles. Historiquement, les événements de contact intercellulaire comme la phagocytose 3 ont été imagées par mélange de deux types de cellules, puis continue la numérisation du champ de vue de trouver des contacts intercellulaires fortuite au stade approprié de l'interaction. La nature stochastique de ces événements rend ce processus fastidieux, et il est difficile d'observer des événements précoces ou fugace contact cellule-cellule par cette approche. Cette méthode nécessite de trouver des paires de cellules qui sont sur le point de contact, et les observer jusqu'à ce qu'ils consomment leur contact, ou n'en ont pas. Pour remédier à ces limitations, nous utilisons piégeage optique comme un non-invasive, méthode non destructive, mais rapide et efficace pour positionner les cellules en culture.
Pièges optiques, ou des pinces optiques, sont de plus en plus utilisés dans la recherche biologique de capturer et de manipuler physiquement les cellules et d'autres particules de taille micronique en trois dimensions 4. La pression de radiation a été observé pour la première et appliquée aux systèmes de pinces optiques en 1970 5, 6, et a d'abord été utilisée pour contrôler les échantillons biologiques en 1987 7. Depuis lors, pinces optiques ont mûri en une technologie à la sonde une variété de phénomènes biologiques 8-13.
Nous décrivons une méthode 14 que les progrès de l'imagerie cellulaire direct en intégrant un piège optique avec la filature de microscopie confocale disque avec contrôle de température et d'humidité pour fournir exquise de contrôle spatial et temporel des organismes pathogènes dans un environnement physiologique pour faciliter les interactions avec les cellules de l'hôte, tel que déterminé par le opérateur. Live, les organismes pathogènes comme Candida albicans et Aspergillus fumigatus, qui peut causer potentiellement mortels, d'infections invasives chez les personnes immunodéprimées 15, 16 (par exemple le sida, la chimiothérapie, les patients et l'orgue de transplantation), ont été piégés optiquement en utilisant des intensités laser non-destructif et déplacé à côté de macrophages, qui peuvent phagocyter l'agent pathogène. Haute résolution, transmis des films légers et basées sur la fluorescence a créé la possibilité d'observer les événements précoces de la phagocytose dans les cellules vivantes. Pour démontrer la large applicabilité de l'immunologie, les cellules T primaires ont également été piégés et manipulés pour former des synapses avec l'anti-CD3 microsphères enrobées in vivo, et imagerie time-lapse de la formation des synapses a également été obtenue. En fournissant une méthode d'exercer fines contrôle spatial de pathogènes vivants à l'égard de cellules immunitaires, les interactions cellulaires peuvent être capturés par microscopie à fluorescence avec une perturbation minimale pour les cellules et peut donner un aperçu puissante dans les réponses précoces de l'immunité innée et adaptative.
Protocol
Discussion
Dans ce travail, nous utilisons un piège optique pour capturer les agents pathogènes de dimensions comprises entre 3 um – 5 um. Bien que les agents pathogènes d'intérêt pour notre laboratoire ont généralement ces dimensions, le système de pince optique décrite ici est flexible pour piéger une large gamme de tailles. En effet pièges optiques ont été utilisés pour capturer les particules allant de simples atomes aux cellules environ 10 um de diamètre. De plus, ce système de piégeage optique était cap…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Massachusetts General Département Hôpital de fonds de médecine interne (JMT, MKM, le MLC, JMV), Institut national d'imagerie biomédicale et Bioingénierie octroi T32EB006348 (CCE), le Centre du Massachusetts General Hospital pour financer la biologie du développement informatique et intégrative et AI062773 ( RJH), les subventions AI062773, DK83756, et DK 043 351 (RJX), la NSF 0643745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) et l'Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des Instituts nationaux de la santé (NIH) AI057999 (JMV ). Nous remercions Nicolas C. Yoder pour les discussions utiles, et feutres Charles (RPI, Inc) pour l'assistance technique.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
Referências
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