동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용
Summary
방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.
Abstract
동적 라이브 셀 이미징은 면역 체계 1, 2 셀 사이의 실시간 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용하지만, phagocytic 세포와 미생물 사이의 공간 및 시간적 통제의 부족은 병원균에 호스트 응답의 초기 상호 작용에 관찰 초점을 맞추고 렌더링이 어려운. 역사적으로, 이러한 phagocytosis 3와 같은 세포 연락처 이벤트는 두 세포 유형을 혼합하여 몇 군데있다, 그리고 지속적으로 상호 작용의 적절한 단계에서 serendipitous 세포 연락처를 찾을 수있는 필드의 전망을 검사합니다. 이러한 이벤트의 확률적 특성은 지루한이 프로세스를 렌더링하고,이 접근법에 의해 세포 – 세포 접촉 초기 또는 덧없는 이벤트를 관찰하기가 어렵습니다. 이 방법은 접촉의 가장자리에있는 셀 쌍을 발견하고, 그들은 완전의 연락처까지 그들을 관찰 필요하거나하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 문화의 세포를 위치로 비침습, 비 – 파괴적인, 그러나 신속하고 효과적인 방법으로 광학 트래핑을 사용합니다.
광학 트랩, 혹은 광학 핀셋은 점점 삼차원 4 셀 및 기타 마이크론 크기의 입자를 캡처하고 육체적으로 조작하는 생물 학적 연구에 활용하고 있습니다. 방사선 압력 먼저 관찰 1970 년 5, 6의 광학 트위터 시스템에 적용하고, 첫번째 1987 7 생물 학적 표본을 제어하는 데 사용였습니다. 이후, 광학 핀셋은 생물학적인 현상 8-13 다양한 탐사하는 기술로 성숙했습니다.
우리는 진보로 결정 호스트 세포와 상호 작용을 촉진하는 생리적 환경에서 병원성 생물의 아름다운 공간과 시간적 제어를 제공하기 위해 온도 및 습도 제어 디스크 공촛점 현미경을 회전과 함께 광학 트랩을 통합하여 세포 이미징을 살고 방법 14 설명 연산자. 라이브, immunocompromised 개인 15, 16 (예 : AIDS, 화학 요법 및 장기 이식 환자)에서 잠재적으로 치명적인, 침략 감염을 일으킬 수 캔디다 albicans와 Aspergillus fumigatus, 같은 병원성 미생물은 광학에 인접한 비파괴 레이저 농도를 사용하여 갇혀 이동되었습니다 병원체를 phagocytose 수 macrophages. 고해상도는 빛과 형광 기반의 동영상을 전송 살아있는 세포의 phagocytosis의 초기 이벤트를 관찰할 수있는 능력을 만들었습니다. 면역학의 광범위한 적용을 설명하기 위해, 기본 T – 세포는 또한 갇혀 있단에 반대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 microspheres와 시냅스를 형성 조작 및 버렸네 형성의 시간 저속 영상도 얻은되었습니다. 면역 세포에 관하여 사는 병원균의 훌륭한 공간적 제어를 발휘하는 방법을 제공함으로써, 세포의 상호 작용은 세포에 최소한의 섭동과 형광 현미경에 의해 캡처 수 있으며, 타고난과 적응 면역 반응의 초기에 강력한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Protocol
Discussion
5 μm의 -이 작품에서 우리는 3 μm의 사이의 크기와 병원균을 캡처하는 광학 트랩을 사용합니다. 저희 연구실에 관심이 병원균은 일반적으로 이러한 차원을 가지고 있지만, 여기에 설명된 광학 트위터 시스템은 크기의 큰 범위를 함정에 융통성이 있습니다. 사실 광학 트랩은 단일 원자의 직경 약 10 μm의 세포에 이르기까지 입자를 캡처하는 데 사용되었습니다. 원형, 타원형, 그리고 생물 학적 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 의학 내부 자금의 매사 추세츠 종합 병원과 (JMT, MKM, MLC, JMV), 바이오 메디컬 이미징 국립 연구소 생물 부여 T32EB006348 (CEC), 매사 추세츠 종합 병원의 전산과 통합 생물학 발전 기금을위한 센터 및 AI062773 (지원했습니다 RJH), 보조금 AI062773, DK83756, 그리고 DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), 미 국립 보건원의 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV ). 우리는 기술 지원을하는 데 도움이 토론을 위해 니콜라스 C. 요더 감사하고, 찰스 펠츠 (RPI 주식 회사).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
Referências
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